[发明专利]一种安水金线鲃脾脏细胞系的构建方法

权利要求书

1.一种安水金线鲃脾脏细胞系的构建方法，该构建方法包括如下步骤：

1)安水金线鲃脾脏的获取：先用80-120ppm的MS-222麻醉安水金线鲃；以75％酒精消毒鱼体后，取其脾脏，加入HBSS消毒液浸泡脾脏组织；浸泡15-30分钟后，将脾脏组织用HBSS消毒液清洗3-5次；

2)原代培养：将通过1)获得的脾脏组织剪成100mm³的组织小块，并将其接种于细胞培养瓶中，在18-24℃培养箱中倒置过夜，次日再加入原代培养液，在18-24℃培养箱中启动原代培养，每三天半量更换所述原代培养液，第6-9天细胞开始从组织块中迁移，20-40天长成细胞单层；

3)传代培养：原代脾脏细胞铺满瓶底80％后开始传代，先吸出培养瓶中的原代培养液，以含0.1-0.2％的胰蛋白酶的胰酶消化法悬起细胞细胞变圆后，加入传代培养液1-2ml以中和胰酶反应，首次传代按1:1传，此后按1:2进行传代，于18-24℃培养箱中继续培养；每4-6天传代一次，传至第8代时，细胞培养液换成基础培养液，所述安水金线鲃脾脏细胞系建立成功，

其中所述HBSS消毒液为含有浓度为100-300IU/ml的青霉素、浓度为100-300μg/ml的链霉素、浓度为20-40μg/ml的庆大霉素以及浓度为20-40μg/ml的两性霉素B的Hanks平衡盐溶液，

其中所述基础培养液为含有占总体积的10-15％的胎牛血清和浓度为300-400mg/l的谷氨酰胺的L-15培养液，

其中所述原代培养液为含有占总体积的15-25％的胎牛血清、浓度为600-800mg/l的谷氨酰胺、浓度为100-200IU/ml的青霉素、浓度为100-300μg/ml的链霉素、浓度为20-40μg/ml的庆大霉素以及浓度为20-40μg/ml的两性霉素B的L-15培养液，

其中所述传代培养液为含有占总体积的10-20％的胎牛血清、浓度为500-600mg/l的谷氨酰胺、浓度为20-40μg/ml的庆大霉素以及浓度为20-40μg/ml的两性霉素B的L-15培养液，

其中所述原代培养液、所述传代培养液和所述基础培养液的pH值为7.2-7.4，渗透压为280-360mOsm/l。

2.如权利要求1所述的构建方法，该构建方法还包括如下细胞冻存与复苏的步骤：

1)配制细胞冻存液：冻存液包括L-15培养液、胎牛血清和DMSO，按4.5：4.5：1的体积比混合，现用现配；

2)细胞冻存：取对数生长期的细胞，经上述胰酶消化后，细胞悬液800-1200rpm离心6-10分钟，弃掉上清液；向细胞沉淀中加入配制的细胞冻存液，重悬，使细胞的浓度为1×10⁶个/ml，将1ml细胞悬液转移至1.8ml冻存管中，将冻存管置于程序降温盒中，-80℃放置24-48小时，然后放入液氮中长期保存；

3)细胞复苏：将上述冻存管从液氮中取出，放入37℃水浴锅中快速摇晃至融化；然后在无菌操作台中，将解冻细胞转移至15ml离心管中，并加入等量基础培养液，800-1000rpm离心6-8分钟，除上清液；用基础培养液重悬细胞，并转移至细胞培养瓶中，18-24℃培养箱中培养，5-9天细胞即长成单层。