[发明专利]检测植烟土壤黑胫病菌定殖量的锁核苷酸增敏实时荧光定量PCR检测方法

摘要

一种检测植烟土壤黑胫病菌定殖量的锁核苷酸增敏实时荧光定量PCR检测方法，该方法以烟草黑胫病菌中的5.8S ribosomal RNA及其相邻的ITS 区域片段设计引物；正向引物为：5’-TGAACGCATATTGCACTTCC-3’；反向引物：  5’-GACAAACCAGTCGCCAATTT-3’；LNA修饰位点以下划线表示。通过普通引物PCR扩增、克隆获得阳性重组质粒，然后以已知浓度的含有目的基因的质粒作为模板同时以LNA修饰的引物进行荧光定量PCR反应，作出标准曲线图以及标准曲线，通过样品检测结果与标准曲线对比，确定待测样品中的黑胫病菌的数量。该检测方法适用于烟草种植土壤中黑胫病菌定殖的检测，高效、简单易行、价格低廉，检测只需在4~5小时内即可完成，具有较高的检测灵敏度，能为我国黑胫病的防控起到一定的作用。

主权项

一种检测植烟土壤黑胫病菌定殖量的锁核苷酸增敏实时荧光定量PCR检测方法，其特征在于：该方法包括如下步骤，（1）以黑胫病菌数量对数值为X轴，定量 PCR扩增仪上测读出的Ct值为Y轴，绘制数量对数与Ct值的标准曲线：采用LNA增敏的定量PCR法将烟草黑胫病菌特异区DNA进行扩增，当扩增出基因片段为251bp时，即得到烟草黑胫病菌特异区DNA；将黑胫病菌特异区DNA插入到载体pMD18‑T载体后，然后转化大肠杆菌，接种有氨苄青霉素的LB平板上，氨苄青霉素在LB平板中的质量浓度为100ng/mL；培养24h后采用质粒试剂盒制备黑胫病菌特异区DNA质粒；将步制备好的质粒经紫外分光光度计A260定量，测得质粒母液质量浓度，后用灭菌后的超纯水稀释，得到母液逐级稀释液；将步得到的逐级稀释液，采用定量PCR扩增法进行扩增，每级稀释液扩增出251bp产物时，记录该Ct值，以每级稀释液拷贝数对数值为X轴，Ct值为Y轴，即绘制出拷贝数与Ct值的标准曲线；（2）从对植烟土壤进行相关取样后进行DNA的提取工作；（3）采用LNA增敏的定量PCR扩增法对待测DNA进行扩增，当扩增出基因片段为251bp的产物时，记录待测DNA的Ct值，将该Ct值带入到步骤（1）得出的标准曲线当中，获得PCR反应中黑胫病菌的拷贝数，根据如下公式计算出黑胫病菌在土壤中的定殖数量；Copies=C_PCR×(V_DNA/V_PCR) ×(1/W_EXT)C_pcr为PCR反应得到的黑胫病菌数量，V_DNA为植烟土壤提取DNA得到的最终溶解量，V_PCR为定量PCR的加样量，W_EXT 为提取DNA所使用的植烟土壤重量。