[发明专利]检测植烟土壤黑胫病菌定殖量的锁核苷酸增敏实时荧光定量PCR检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，具体涉及一种检测植烟土壤黑胫病菌定殖量的锁核苷酸增敏实时荧光定量PCR检测方法，适用于各种植烟土壤中的烟草黑胫病菌孢子数量的定量检测。

背景技术

烟草黑胫病是一种毁灭性土传真菌病害。有报导表明在我国烟草黑胫病平均发病率为10％～20％，发病率高的田块高达75％（刘晓霞等，2004），较为严重的甚至造成绝收（陈瑞泰等，1997；苏德成，1992）。我国每年烟草因黑胫病引起的损失超过2亿元（赵振山，2005），烟草黑胫病（Tobaccoblackshank）是疫霉菌烟草变种引起的一种土传病害，其中受土壤环境和栽培措施影响较大，在河南、山东和安徽、云南、贵州、四川、湖南、广东、广西、福建等烟区发生。

以前较为传统的植物病害诊断方法常根据病组织的症状和病原菌的特征进行，但是效率较低且耗时较多。近年来血清学和核酸技术的应用，为植物病原的快速检测提供了不少新技术。有人采用RFLPs技术对F.axysporumf.sp.pisi的3个生理小种进行研究，差异明显（Coddington，1992)。Kistler(1989)等人对mtDNAs的差异进行分析，能够区别出尖镰孢Fusariumoxysporum的不同转化型；谢勇等根据从GeneBank数据库获得的引起黑胫病的疫霉属真菌rDNAITS区段序列，合成了1对17bpDNA特异引物进行了不同病原菌、病组织及土壤中寄生疫霉菌(Parasiticavar.nicotianae)的特异扩增试验，创制了一套快速检测的PCR方法。目前的检测方法灵敏度较低，研制敏感性更高的烟草黑胫病菌检测方法是当务之急。

锁核酸(Lockednucleicacid,LNA)是一种近年来开始被人们关注的新型的寡核酸衍生物,在药学研究方面引起了人们的广泛关注，有望成为分子治疗一些疾病如癌症的突破口。其结构中B-D-呋喃核糖的2-O,4-C位通过缩水作用构成环形的氧亚甲基桥、硫亚甲基桥或胺亚甲基桥,呋喃糖的结构锁定在C3内型的N构型,形成了刚性的缩合结构。L环形桥锁定了呋喃糖的N构型,降低核糖结构的柔韧性,增加磷酸盐骨架的稳定性。在寡核苷酸中加入锁（LNA）修饰碱基可显著增强寡核苷酸与DNA的结合能力；含有LNA修饰的碱基的引物已经广泛应用于荧光PCR反应体系。但目前尚未发现此类技术应用于烟草黑胫病菌在植烟土壤中的检测方面。

发明内容

本发明的目的正是基上述现有状况提供了一种LNA增敏的植烟土壤黑胫病菌孢子数量的荧光定量PCR检测方法。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：

一种检测烟草黑胫病菌在植烟土壤中定殖数量的方法，包括如下步骤，

（1）以黑胫病菌数量对数值为X轴，荧光PCR扩增仪读出的Ct值为Y轴，绘制数量对数与Ct值的标准曲线：

采用LNA增敏的定量PCR方法将烟草黑胫病菌特异区DNA进行扩增，当扩增出基因片段为251bp时，即得到烟草黑胫病菌特异区DNA；

将黑胫病菌特异区DNA插入到感受态大肠杆菌载体pMD18-T载体后，接种到含有氨苄青霉素的LB培养基中，氨苄青霉素在LB培养基中的质量浓度为100ng/mL；培养24h后采用质粒试剂盒（TAKARA公司）制备烟草黑胫病菌特异区DNA质粒（制备过程按照该公司提供的说明书）；

将步制备好的质粒经紫外分光光度计A260定量，测得质粒母液质量浓度，然后用灭菌后的超纯水稀释，得到母液逐级稀释液；

将步得到的逐级稀释液，采用荧光定量PCR扩增法进行扩增，每级稀释液扩增出251bp产物时，记录该Ct值，以每级稀释液拷贝数对数值为X轴，CT值为Y轴，即绘制出拷贝数与Ct值得标准曲线；

（2）从烟区进行感染黑胫病烟株附近土壤的取样后，提取DNA；

（3）采用LNA增敏的荧光定量PCR扩增法对待测DNA进行扩增，当扩增出基因片段为251bp的产物时，记录此时待测DNA的Ct值，将该Ct值带入到步骤（1）绘制出的标准曲线当中，得到PCR反应体系中黑胫病菌拷贝数，根据如下公式计算出黑胫病菌在土壤中的定殖数量；

Copies=C_PCR×(V_DNA/V_PCR)×(1/W_EXT)