[发明专利]检测植烟土壤黑胫病菌定殖量的锁核苷酸增敏实时荧光定量PCR检测方法

权利要求书

1.一种检测植烟土壤黑胫病菌定殖量的锁核苷酸增敏实时荧光定量PCR检测方法，其特征在于：该方法包括如下步骤，

（1）以黑胫病菌数量对数值为X轴，定量PCR扩增仪上测读出的Ct值为Y轴，绘制数量对数与Ct值的标准曲线：

采用LNA增敏的定量PCR法将烟草黑胫病菌特异区DNA进行扩增，当扩增出基因片段为251bp时，即得到烟草黑胫病菌特异区DNA；

将黑胫病菌特异区DNA插入到载体pMD18-T载体后，然后转化大肠杆菌，接种有氨苄青霉素的LB平板上，氨苄青霉素在LB平板中的质量浓度为100ng/mL；培养24h后采用质粒试剂盒制备黑胫病菌特异区DNA质粒；

将步制备好的质粒经紫外分光光度计A260定量，测得质粒母液质量浓度，后用灭菌后的超纯水稀释，得到母液逐级稀释液；

将步得到的逐级稀释液，采用定量PCR扩增法进行扩增，每级稀释液扩增出251bp产物时，记录该Ct值，以每级稀释液拷贝数对数值为X轴，Ct值为Y轴，即绘制出拷贝数与Ct值的标准曲线；

（2）从对植烟土壤进行相关取样后进行DNA的提取工作；

（3）采用LNA增敏的定量PCR扩增法对待测DNA进行扩增，当扩增出基因片段为251bp的产物时，记录待测DNA的Ct值，将该Ct值带入到步骤（1）得出的标准曲线当中，获得PCR反应中黑胫病菌的拷贝数，根据如下公式计算出黑胫病菌在土壤中的定殖数量；

Copies=C_PCR×(V_DNA/V_PCR)×(1/W_EXT)

C_pcr为PCR反应得到的黑胫病菌数量，V_DNA为植烟土壤提取DNA得到的最终溶解量，V_PCR为定量PCR的加样量，W_EXT为提取DNA所使用的植烟土壤重量。

2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：步骤（1）和步骤（3）中荧光定量PCR扩增中所用的试剂包括12.5μl的2×荧光定量PCR反应混合液，浓度均为10umol/L的正向引物、反向引物各1μl,1ul的黑胫病菌特异区DNA质粒溶液或待测黑胫病菌DNA溶液，超纯水补至25μl。

3.根据权利要求２所述的检测方法，其特征在于，所述的LNA修饰的正向引物和反向引物的序列如下：正向引物为：5’-TGAACGCATATTGCACTTCC-3’；反向引物：5’-GACAAACCAGTCGCCAATTT-3’；LNA修饰位点以下划线表示。

4.根据权利１所述的检测方法，其特征在于，所述的步骤（1）和步骤（3）的反应条件为95℃热启动8分钟预变性后；进入扩增循环：95℃30秒，60℃10秒，72℃20秒循环45次。