[发明专利]一种海马血管紧张素转化酶抑制肽的制备方法

摘要

本发明公开了一种海马血管紧张素转化酶抑制肽的制备方法，特点是包括脱脂海马粉制备步骤；将脱脂海马粉依次用胰蛋白酶和碱性蛋白酶酶解后，过滤得到海马蛋白酶解液；将海马蛋白酶解液用超滤膜进行超滤收集分子量大于20KDa的滤液，并进行浓缩和冷冻干燥得到海马蛋白粉的步骤；最后将海马蛋白粉与水混合后加入木瓜蛋白酶进行酶解，将酶解液沸水灭活离心后，取沉淀冷冻干燥即得到海马ACE抑制肽粉末，最近依次采用Sephadex G-15凝胶过滤、反相高效液相色谱法进行分离纯化，收集高活性组分即可，优点是工艺简单、操作方便且本法制备多肽水解度高，多肽片段分子量较小，活性高。

主权项

一种海马血管紧张素转化酶抑制肽的制备方法，其特征在于包括以下步骤：（1）海马前处理：将海马洗净冻好后，于‑80 ℃下冷冻干燥48 h，再用粉碎机粉碎，然后采用CO₂超临界流体萃取技术脱除脂肪酸，得到脱脂海马粉；（2）海马蛋白液制备：将步骤（1）得到的脱脂海马粉与水按40‑60g/L的比例混合后，依次用胰蛋白酶和碱性蛋白酶酶解后，用滤纸过滤取上清液，即为海马蛋白酶解液；将海马蛋白酶解液用截留分子量为20KDa的超滤膜进行超滤，收集分子量大于20KDa的滤液，并进行浓缩和冷冻干燥得到海马蛋白粉； （3）ACE抑制肽制备：将步骤（2）中得到的海马蛋白粉与水按400‑600g/L的比例混合后，加入海马蛋白粉质量5%的木瓜蛋白酶进行酶解，酶解温度为59 ℃，时间为7.5 h，pH为7.7，将酶解液沸水灭活10分钟后，于4000 rpm离心10 min，取沉淀冷冻干燥即得到海马ACE抑制肽粉末； （4）ACE抑制肽纯化：采用Sephadex G‑15凝胶过滤对步骤（3）制备得到的ACE抑制肽粉末进行分离纯化，上样量2mL，ACE抑制肽粉末浓度为0.05g/mL，洗脱速度1.0 mL/min，3 mL/管，收集PH‑I3、PH‑I4和PH‑I5 三个组分；采用反相高效液相色谱法分别对PH‑I3、PH‑I4和PH‑I5 三个组分进行分离纯化，设置A相为含有体积百分数0.1% 三氟乙酸的水溶液，B相为含有体积百分数0.1% 三氟乙酸的乙腈溶液进行梯度洗脱，检测波长为220nm，其中PH‑I3的洗脱条件为0‑35min，0‑32% B相，流速为1mL/min，收集组分PH‑I3‑5；PH‑I4的洗脱条件为0‑10min，100% A相；10‑40 min，0‑24% B相，流速为1mL/min，收集组分PH‑I4‑3；PH‑I5的洗脱条件为0‑40 min，0‑35% B相，流速为0.8mL/min，收集组分PH‑I5‑3，合并PH‑I3‑5、PH‑I4‑3和PH‑I5‑3三个组分，冷冻干燥，即得到高活性的ACE抑制肽粉末。