[发明专利]一种海马血管紧张素转化酶抑制肽的制备方法

权利要求书

1.一种海马血管紧张素转化酶抑制肽的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

（1）海马前处理：将海马洗净冻好后，于-80℃下冷冻干燥48h，再用粉碎机粉碎，然后采用CO₂超临界流体萃取技术脱除脂肪酸，得到脱脂海马粉；

（2）海马蛋白液制备：将步骤（1）得到的脱脂海马粉与水按40-60g/L的比例混合后，依次用胰蛋白酶和碱性蛋白酶酶解后，用滤纸过滤取上清液，即为海马蛋白酶解液；将海马蛋白酶解液用截留分子量为20KDa的超滤膜进行超滤，收集分子量大于20KDa的滤液，并进行浓缩和冷冻干燥得到海马蛋白粉；

（3）ACE抑制肽制备：将步骤（2）中得到的海马蛋白粉与水按400-600g/L的比例混合后，加入海马蛋白粉质量5%的木瓜蛋白酶进行酶解，酶解温度为59℃，时间为7.5h，pH为7.7，将酶解液沸水灭活10分钟后，于4000rpm离心10min，取沉淀冷冻干燥即得到海马ACE抑制肽粉末；

（4）ACE抑制肽纯化：采用SephadexG-15凝胶过滤对步骤（3）制备得到的ACE抑制肽粉末进行分离纯化，上样量2mL，ACE抑制肽粉末浓度为0.05g/mL，洗脱速度1.0mL/min，3mL/管，收集PH-I3、PH-I4和PH-I5三个组分；采用反相高效液相色谱法分别对PH-I3、PH-I4和PH-I5三个组分进行分离纯化，设置A相为含有体积百分数0.1%三氟乙酸的水溶液，B相为含有体积百分数0.1%三氟乙酸的乙腈溶液进行梯度洗脱，检测波长为220nm，其中PH-I3的洗脱条件为0-35min，0-32%B相，流速为1mL/min，收集组分PH-I3-5；PH-I4的洗脱条件为0-10min，100%A相；10-40min，0-24%B相，流速为1mL/min，收集组分PH-I4-3；PH-I5的洗脱条件为0-40min，0-35%B相，流速为0.8mL/min，收集组分PH-I5-3，合并PH-I3-5、PH-I4-3和PH-I5-3三个组分，冷冻干燥，即得到高活性的ACE抑制肽粉末。

2.根据权利要求1所述的一种海马血管紧张素转化酶抑制肽的制备方法，其特征在于步骤（1）中所述的CO₂超临界萃取技术进行脱脂的条件为：萃取温度为58℃、萃取压强为35MPa、静态萃取10min后调节CO2流量为15L/h、动态萃取时间为125min的萃取条件下对海马骨粉进行脱脂。

3.根据权利要求1所述的一种海马血管紧张素转化酶抑制肽的制备方法，其特征在于：步骤（2）中所述的胰蛋白酶的酶解条件为温度45℃、时间4h、pH8.8、添加质量为脱脂海马粉的4%；碱性蛋白酶酶解温度54.70℃、时间6h、pH9.0、添加质量为脱脂海马粉的为4%。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的一种海马ACE抑制肽的制备方法，其特征在于：所述的海马包括大海马、三斑海马、线纹海马、日本海马、刺海马。