[发明专利]一种临床级别脂肪干细胞的制备和储存方法

摘要

本发明公开了一种临床级别脂肪干细胞的制备和储存方法,采用无动物源蛋白质污染的无血清的完全培养基，进行脂肪组织来源的间充质干细胞培养，安全有效，无免疫原性，能更好地维持ADSCs的增殖率，平台期延长，且每代细胞扩增倍数远远提高，保证了临床治疗的数量，是第一次在制备临床级别的ADSCs中的应用无血清的完全培养基；本发明从腹部采集脂肪组织，可以间断性反复取材，避免了抽脂过程对脂肪干细胞的损伤；本发明应用贴壁法制备ADSCs，提高了原代细胞的产量，降低了成本；本发明应用新型的无血清细胞冻存液符合临床应用标准，减少了DMSO的用量，对ADSCs的活率、表型和倍增时间无明显影响，可以复苏后直接用于临床输注，便于运输，保证了临床治疗的安全性。

主权项

一种临床级别脂肪干细胞的制备方法,其特征在于，包括以下几个步骤：(1)、病原灭活的血小板裂解液PL的制备机采自体血小板或者从中心血站收集过期的血小板，在20～25℃、1200～1500rpm下离心10～15min进行病原灭活；连续进行3～5个循环的‑80℃冻存和37℃复苏，充分裂解血小板，在4000rpm下离心30min，收集血小板裂解液，冻存在‑80℃备用，冻存期间进行病原学检测；(2)、原代ADSCs培养获取腹部皮下正常脂肪组织500～1000mg，用无钙镁D‑Hank’s液冲洗3‑5次，用眼科剪剪破脂肪组织中肉眼可见的细小血管，充分冲洗血液后，将脂肪组织剪碎至1‑3mm大小；将剪碎后的脂肪组织块均匀接种在T75培养瓶底部，在37℃、5％体积浓度的CO2培养箱中孵育，于第二天添加无血清的完全培养基，以后隔天观察细胞，可见细胞从组织块中生长，此为P0代细胞；(3)、ADSCs传代当P0代细胞达到80‑90％融合度时，去除培养瓶中的旧培养基，用PBS缓冲液冲洗2‑3次，加入0.25％质量浓度的胰酶和0.04％质量浓度的EDTA消化液，待细胞悬浮后，加入等体积的完全培养基终止消化，将单细胞悬液移至离心管中，1000rpm离心5min，弃上清，加入无血清完全培养基，调整细胞密度为1～5×10⁵/ml，继续培养，此为P1代细胞；待P1代达到90％以上融合时，再次将细胞消化传代，按照此种方法，将ADSCs连续传代；(4)、收集P3代细胞进行流式细胞仪细胞表型检测和鉴定。