[发明专利]一种临床级别脂肪干细胞的制备和储存方法

说明书

技术领域

本发明涉及干细胞的应用领域，具体为一种临床级别脂肪干细胞的制备和储存方法。

背景技术

间充质干细胞：是干细胞家族的重要成员，来源于发育早期的中胚层，属于多能干细胞。间充质干细胞最初在骨髓中发现，因其具有多向分化潜能、造血支持和促进干细胞植入、免疫调控和自我复制等特点而日益受到人们的关注。如间充质干细胞在体内或体外特定的诱导条件下，可分化为脂肪、骨、软骨、肌肉、肌腱、韧带、神经、肝、心肌、内皮等多种组织细胞，连续传代培养和冷冻保存后仍具有多向分化潜能，可作为理想的种子细胞用于衰老和病变引起的组织器官损伤修复。

脂肪干细胞：(adipose-derivedstemcells，ADSCs)：是近年来从脂肪组织中分离得到的一种具有多向分化潜能的干细胞。不仅在体内体外具有多向分化潜能，在不同的诱导因子作用下可以向脂肪细胞、软骨细胞、肌细胞、成骨细胞、神经细胞、神经胶质细胞及胰岛细胞分化，而且可以分泌多种促血管生成因子和抗凋亡因子。

血小板裂解液(plateletlysate,PL)：血小板浓缩物富含转化生长因子，血小板源性生长因子，胰岛素样生长因子等生长因子，输注人体内不会引起异种蛋白的免疫，可以从不同方面对组织中细胞和基质的再生起到促进作用，从而加速组织的修复，无疾病传播和免疫排斥的潜在危险。

细胞冻存：细胞冻存是细胞保存的主要方法之一。利用冻存技术将细胞置于-196℃液氮中低温保存，可以使细胞暂时脱离生长状态而将其细胞特性保存起来，这样在需要的时候再复苏细胞进行应用。细胞冻存时向培养基中加入保护剂，如二甲基亚砜(DMSO)，可使溶液冰点降低，加之在缓慢冻结条件下，细胞内水分透出，减少了冰晶形成，从而避免细胞损伤。

2001年,Zuk等首次成功分离脂肪来源间充质干细胞(ADSCs),由于其不仅具有很强的体外扩增能力和多向分化潜能，且来源充足、易于分离培养,成为研究新热点,并呈现出良好的前景。

脂肪干细胞是一种存在于脂肪组织中的间充质干细胞，在皮下白色脂肪组织中约占细胞总量的10～20％，与其他来源干细胞相比，ADSCs在分离培养上有很大优势：(1)取材方便。脂肪组织储备丰富,取材痛苦小。目前一次吸脂术可获得200ml脂肪，分离出约1×10⁶干细胞，为骨髓分离量的40倍。(2)分离简单。外周脂肪经机械剪切，胶原酶消化和简单梯度离心就可获得ADSCs。(3)易于培养。ADSCs呈成纤维细胞样生长，具有很强的体外扩增能力。多次传代(10～20代)后,细胞增殖速度无明显减慢,传代6次后细胞群体中出现衰老细胞，第15代中衰老细胞约占15％。

ADSCs能够促进血管新生，从而改善局部缺血组织的情况。这一特点使得ADSCs在临床治疗上具有相当广阔的应用前景。急性心肌梗死、缺血性心肌病、末梢血管疾病、急性肾小管坏死、糖尿病性视网膜病变、缺血性脑病、外伤性脊髓损伤以及移植中发生的局部缺血都将有希望通过ADSCs进行治疗。尽管ADSCs能够促使血管发生的机制尚不清楚，但研究发现ADSCs能够分泌大量血管生长因子VEGF、HGF、bFGF、血管生成素、GM-CSF、MCP-1和SDF-1α。

ADSCs有免疫豁免与免疫调节的免疫学特性。体外培养时，ADSCs低表达或者不表达造血细胞及HLA-DR抗原等免疫相关关键分子，提示ADSCs具有同种异体移植潜能。ADSCs还能够通过分泌抗炎症细胞因子和抑制受体T细胞增殖与调动，诱导机体发生免疫抑制或者免疫耐受，实现其免疫调节功能,促进异种或同种异体移植物的成活。

与其他来源的干细胞相比，ADSCs具有明显的优越性，它易获得又安全，对病人的损伤小，脂肪组织也容易再生，可以反复取材。同时，ADSCs进行自体移植可以克服种属和免疫障碍。因此寻求一种临床级别的自体脂肪干细胞的制备和储存方法，能更好地早期储备种子干细胞，为今后的疾病治疗和预防提供途径。

现有技术获取ADSCs细胞的技术方案为：

(1)、脂肪组织来源于吸脂术或者脂肪块,将脂肪组织剪碎至1-3mm大小组织块，PBS缓冲盐溶液冲洗3遍。

(2)、测量脂肪的体积，向其加入0.5％质量浓度的Ⅰ型胶原酶，使终浓度为0.075％，37℃下消化30min，加入同体积的含体积分数10％胎牛血清(FBS)的L-DMEM培养基终止消化，充分混匀后，1500rpm/min离心5min，弃去上清液。