[发明专利]一种临床级别脂肪干细胞的制备和储存方法

权利要求书

1.一种临床级别脂肪干细胞的制备方法,其特征在于，包括以下几个步骤：

(1)、病原灭活的血小板裂解液PL的制备

机采自体血小板或者从中心血站收集过期的血小板，在20～25℃、1200～1500rpm下离心10～15min进行病原灭活；

连续进行3～5个循环的-80℃冻存和37℃复苏，充分裂解血小板，在4000rpm下离心30min，收集血小板裂解液，冻存在-80℃备用，冻存期间进行病原学检测；

(2)、原代ADSCs培养

获取腹部皮下正常脂肪组织500～1000mg，用无钙镁D-Hank’s液冲洗3-5次，用眼科剪剪破脂肪组织中肉眼可见的细小血管，充分冲洗血液后，将脂肪组织剪碎至1-3mm大小；

将剪碎后的脂肪组织块均匀接种在T75培养瓶底部，在37℃、5％体积浓度的CO2培养箱中孵育，于第二天添加无血清的完全培养基，以后隔天观察细胞，可见细胞从组织块中生长，此为P0代细胞；

(3)、ADSCs传代

当P0代细胞达到80-90％融合度时，去除培养瓶中的旧培养基，用PBS缓冲液冲洗2-3次，加入0.25％质量浓度的胰酶和0.04％质量浓度的EDTA消化液，待细胞悬浮后，加入等体积的完全培养基终止消化，将单细胞悬液移至离心管中，1000rpm离心5min，弃上清，加入无血清完全培养基，调整细胞密度为1～5×10⁵/ml，继续培养，此为P1代细胞；

待P1代达到90％以上融合时，再次将细胞消化传代，按照此种方法，将ADSCs连续传代；

(4)、收集P3代细胞进行流式细胞仪细胞表型检测和鉴定。

2.如权利要求1所述的一种临床级别脂肪干细胞的制备方法,其特征在于，所述的步骤(2)中的无血清的完全培养基为添加有5-10％质量浓度的PL的α-MEM培养基。

3.一种临床级别脂肪干细胞的储存方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)、选取第P4或者P5代的ADSCs细胞进行冻存；

2)、将步骤1)中的ADSCs细胞用胰酶消化，加入预冷冻存液，调整细胞悬液的浓度为1×10⁶/ml，放入预冷的冻存管中；

3)、通过程序降温仪，将冻存管投入液氮中保存；

4)、6个月后复苏，调整细胞浓度为1×10⁴/ml，接种于24孔板，每孔1ml，每3天换液一次，每隔24h胰酶消化后计数，根据生长情况计算倍增时间。

4.如权利要求3所述的一种临床级别脂肪干细胞的储存方法，其特征在于，所述步骤2)预冷冻存液为含5％质量浓度的DMSO，2～5％质量浓度的人血白蛋白，1～5％质量浓度的低分子右旋糖酐，30～35％质量浓度的葡萄糖，30～35％质量浓度的生理盐水的冻存液。