[发明专利]一种利用绿竹花芽进行快速高效再生体系的建立方法

摘要

本发明公开了一种利用绿竹花芽进行快速高效再生体系的建立方法，按下列步骤进行一是无菌花芽体系的建立，二是愈伤组织诱导培养，三是愈伤组织的继代培养，四是愈伤组织的分化培养，五是试管苗的生根培养，六是再生植株的炼苗和移栽。本发明涉及一种以竹子的花芽为外植体的植物组培方法，是对以竹子花芽为外植体经愈伤组织诱导建立再生体系的有益尝试，采用本方法能够使外植体诱导出愈伤组织，并建立再生体系，为该竹子育种及遗传转化研究创造有利条件。本方法简单易行、利于推广，实施条件宽松，效果显著。

主权项

一种利用绿竹花芽进行快速高效再生体系的建立方法，其特征在于按下列步骤进行：1）无菌花芽的获得选取健壮、生长力旺盛、无病斑的绿竹植株，切下侧芽，经消毒处理后，在解剖显微镜下切下无菌芽尖为外植体，将芽尖接种在增殖培养基中，基本培养基为MS，添加的外源激素为6‑BA 即6‑苄基腺嘌呤，浓度为1mg·L‑1；培养条件：光培养，光强2400lux，光周期16/8h，温度25±2℃，随着继代次数增加，竹子出现试管开花，取开花植株的花芽作为外植体，无菌花芽在原培养基中继代培养；2）愈伤组织诱导培养诱导愈伤组织所用的花芽选用步骤1）已经建立好的无菌花芽体系，将0.05 ‑ 0.1cm长的花芽接种于诱导培养基中：愈伤组织诱导基本培养基为MS培养基，添加的外源激素为2,4‑D即2,4‑二氯苯氧乙酸，2,4‑D浓度为2mg·L‑1，并在诱导培养基中添加500 mg·L‑1的水解酪蛋白、500 mg·L‑1的脯氨酸和500 mg·L‑1的谷氨酰胺；pH为5.7；诱导条件为：暗培养，温度25±2℃；3）愈伤组织增殖培养一个月后，将诱导出的致密愈伤组织转移到新的培养基中增殖培养，愈伤组织增殖培养基同诱导培养基，pH为5.7；培养条件为：暗培养，温度25±2℃；4）分化培养将经过增殖培养的致密愈伤组织接种在分化培养中进行分化，分化培养基同诱导培养基， pH为5.7；培养条件为：光培养，光强2400lux，光周期16/8h，温度25±2℃；5）生根培养将从分化培养基分化出的再生植株长到3‑5cm时移入生根培养基中进行生根；生根培养基为 MS培养基，pH为5.7；培养条件为：光培养，光强2400lux，光周期16/8h，温度25±2℃；6）再生植株的移栽一个月后，选取根长势粗壮的再生苗进行驯化移栽，将其放在驯化室20000lux强光下炼苗一周，然后取出试管苗，用30‑40℃温水洗净根部的培养基，将植株移栽于混合培养基质中，并进行单株套袋，定期浇水，一周后剪去塑料袋两角，两周后完全脱袋，当植株长出新叶，生长稳定时移栽至温室；其中，步骤1）中消毒处理是指用清洗剂清洗干净，用体积分数为0.005的次氯酸钠溶液浸泡10min，次氯酸钠溶液中添加有吐温‑20，吐温‑20的添加量为每50ml次氯酸钠溶液中添加一滴，然后用无菌水冲洗4‑5次。