[发明专利]一种干细胞制剂及其在血管介入治疗脑卒中的用途

摘要

本发明公开了一种新型干细胞制剂及其在血管介入治疗脑卒中的用途，并且提供了所述干细胞制剂中干细胞的制备方法和步骤，及其在用于制备治疗脑卒中患者的药物中的用途。本发明新型干细胞制剂移植后取得了优良效果，并且制备成本低廉，得到的细胞容易大量扩增，为脑卒中等神经系统疾病的治疗开辟了新的天地，为脑卒中患者带来了福音。该制剂的干细胞具有较高的分化程度，在血管介入治疗脑卒中时能促进病人神经功能恢复，提高细胞定植率，并且易于制备，便于应用，疗效较同类药物有明显提升。

主权项

1.一种应用于血管介入治疗脑卒中的干细胞制剂，是通过以下方法制备的，具体步骤如下：步骤1，组织的制备和消化：无菌条件下制备1mm3大小的脐带组织匀浆，以无血清培养基定容，以1:1的体积比加入0.2%胶原酶Ⅱ，37℃，持续磁力搅拌下消化30分钟；然后继续加入终浓度为0.05%的胰蛋白酶‑EDTA，在37℃环境中继续磁力搅拌消化30分钟后，加入10%体积的胎牛血清(FBS)终止消化；步骤2，原始细胞的收集与原代细胞的培养：将上述步骤1的消化产物先后经100目及200目细胞筛过滤收集原始细胞，然后以1.0×105细胞/ml将细胞接种于细胞培养瓶中，置于37℃，5%CO2，饱和湿度的细胞培养箱中培养，培养4～5天后全量换液，弃去未贴壁细胞，以后每3～4天半量换液一次，即原代细胞培养，记为P0代细胞；步骤3，原代细胞的传代与扩增：观察原代培养的细胞贴壁融合生长至80～90%时，吸弃培养瓶内原有培养液，吸取10ml 0.01M PBS缓冲液轻轻加入培养瓶内洗涤两遍，弃去洗液，并用0.025%～0.05%的胰蛋白酶‑EDTA进行消化3～6分钟，以1:3～1:4比例传代培养，记为P1代细胞；步骤4，细胞传代与扩增：待细胞融合生长至80～90%时，重复上述步骤3操作进行洗涤和消化，传代比例为1:3，记为P2、P3、P4…代细胞；步骤5，细胞预诱导：取P4～P6代细胞，当细胞贴壁生长融合至80～90%时，吸除培养瓶内原有培养液，取10ml 0.01M PBS轻轻加入培养瓶内洗涤两遍，弃去洗液，加入0.025%～0.05%胰蛋白酶‑0.01% EDTA消化液1.0ml，浸漫覆盖瓶底，倒置显微镜下观察见细胞呈圆形漂起时，加入1.0ml FBS中止胰蛋白酶消化；加入10ml 0.01M PBS反复吹打冲洗，在室温下900rpm离心10分钟；弃去上清液后，加入10ml完全培养液重悬细胞，在T25cm2培养瓶中接种2×105细胞/ml，培养液保持5ml/瓶；置37℃，5%CO2，饱和湿度培养箱中培养6～8天，传代后第2天换液一次，以后每3天换液一次；步骤6，细胞诱导：将上述步骤5细胞融合至80～90%时，操作同步骤5清洗、消化、终止消化后获得干细胞，在室温下900rpm 离心10分钟，弃去上清液后，以2×105细胞/ml重新接种在T25cm2培养瓶中；培养液保持5ml/瓶；置37℃，5%CO2，饱和湿度培养箱中培养20天，传代后第2天换液一次，以后每3天换液一次；步骤7，终产物干细胞的预处理：将上述步骤6培养的干细胞和培养液一起吸至离心管，1000rpm 离心5分钟，弃上清；重悬细胞并用梯度吸管吹打，分散大的细胞团为单细胞或小的细胞团，按1:3～1:4传代；置37℃，5%CO2，饱和湿度培养箱中培养6～8天，传代后第2天换液一次，以后每3天换液一次，即获得终产物干细胞；步骤8，终产物干细胞的处理：将步骤7预处理后的终产物干细胞用浓度为0.25%的胰酶消化，用相当于5倍胰酶消化液体积的不含血清的培养液来终止消化，1000rpm离心5分钟，以步骤7所用的细胞培养基重悬离心沉淀后的终产物干细胞，混匀后装入注射瓶中，无菌密封，其中，干细胞的浓度是1×106～1×107个/ml；步骤9：用免疫细胞化学染色法对所得终产物干细胞进行鉴定，主要标志物为神经元特异性烯醇化酶（NSE）、胶质纤维酸性蛋白（GFAP）和神经微管相关蛋白‑2（MAP‑2），且细胞NSE的表达率为90%以上，GFAP和MAP‑2表达结果为阴性；其中：步骤2中细胞培养瓶在细胞接种前用FBS进行包被，将FBS均匀浸润细胞培养瓶并置37℃，5%CO2，饱和湿度培养箱孵育30分钟即为包被；步骤2中原代细胞培养所用的完全培养基为含20% FBS，2ng/ml表皮细胞生长因子(EGF)，100U/ml青霉素，100μg/ml链霉素，25mM左旋谷氨酞胺(L‑Glu)的F12完全培养液；步骤3～4中传代细胞培养所用的完全培养基为含10% FBS，100 U/ml青霉素，100μg/ml链霉素的DMEM/F12完全培养液；步骤5中细胞培养所用的完全培养基为含10%人AB血清、100 U/ml青霉素和100μg/ml链霉素的F12完全培养液，并添加了50ng/ml成纤维细胞生长因子（bFGF）、100ng/ml成纤维细胞生长因子 8（FGF8）、500ng/ml音猬因子（SHH）和10ng/ml白血病抑制因子（LIF）；步骤6中细胞培养所用的完全培养基为含3% N2/B27，B27的成分为：2mmol/L L‑谷氨酰胺、30nmol/L亚硒酸钠、20nmol/L孕酮、60μmol/L腐胺、100μg/ml转铁蛋白、25μg/ml胰岛素、质量分数为16%葡萄糖；N2的成分为：100μg/ml转铁蛋白、25μg/ml胰岛素、20nmol/L孕酮、60μmol/L腐胺、30nmol/L亚硒酸钠，100u/ml青霉素，100μg/ml链霉素的无血清neurobasal media，添加了50ng/ml bFGF，100ng/ml成纤维细胞生长因子（FGFs）和500ng/ml音猬因子（SHH）；步骤7中细胞培养所用的完全培养基为含10～20ng/ml表皮细胞生长因子(EGF)，0.2～0.4mg/ml三磷酸胞苷二钠(CTP)，3～5 mmol/L氯化锂(LiCl)的F12细胞培养液，且不含酚红。