[发明专利]一种干细胞制剂及其在血管介入治疗脑卒中的用途

权利要求书

1.一种应用于血管介入治疗脑卒中的干细胞制剂，是通过以下方法制备的，具体步骤如下：

步骤1，组织的制备和消化：无菌条件下制备1mm³大小的脐带组织匀浆，以无血清培养基定容，以1:1的体积比加入0.2%胶原酶Ⅱ，37℃，持续磁力搅拌下消化30分钟；然后继续加入终浓度为0.05%的胰蛋白酶-EDTA，在37℃环境中继续磁力搅拌消化30分钟后，加入10%体积的胎牛血清(FBS)终止消化；

步骤2，原始细胞的收集与原代细胞的培养：将上述步骤1的消化产物先后经100目及200目细胞筛过滤收集原始细胞，然后以1.0×10⁵细胞/ml将细胞接种于细胞培养瓶中，置于37℃，5%CO₂，饱和湿度的细胞培养箱中培养，培养4～5天后全量换液，弃去未贴壁细胞，以后每3～4天半量换液一次，即原代细胞培养，记为P0代细胞；

步骤3，原代细胞的传代与扩增：观察原代培养的细胞贴壁融合生长至80～90%时，吸弃培养瓶内原有培养液，吸取10ml 0.01M PBS缓冲液轻轻加入培养瓶内洗涤两遍，弃去洗液，并用0.025%～0.05%的胰蛋白酶-EDTA进行消化3～6分钟，以1:3～1:4比例传代培养，记为P1代细胞；

步骤4，细胞传代与扩增：待细胞融合生长至80～90%时，重复上述步骤3操作进行洗涤和消化，传代比例为1:3，记为P2、P3、P4…代细胞；

步骤5，细胞预诱导：取P4～P6代细胞，当细胞贴壁生长融合至80～90%时，吸除培养瓶内原有培养液，取10ml 0.01M PBS轻轻加入培养瓶内洗涤两遍，弃去洗液，加入0.025%～0.05%胰蛋白酶-0.01% EDTA消化液1.0ml，浸漫覆盖瓶底，倒置显微镜下观察见细胞呈圆形漂起时，加入1.0ml FBS中止胰蛋白酶消化；加入10ml 0.01M PBS反复吹打冲洗，在室温下900rpm离心10分钟；弃去上清液后，加入10ml完全培养液重悬细胞，在T25cm²培养瓶中接种2×10⁵细胞/ml，培养液保持5ml/瓶；置37℃，5%CO₂，饱和湿度培养箱中培养6～8天，传代后第2天换液一次，以后每3天换液一次；

步骤6，细胞诱导：将上述步骤5细胞融合至80～90%时，操作同步骤5清洗、消化、终止消化后获得干细胞，在室温下900rpm 离心10分钟，弃去上清液后，以2×10⁵细胞/ml重新接种在T25cm²培养瓶中；培养液保持5ml/瓶；置37℃，5%CO₂，饱和湿度培养箱中培养20天，传代后第2天换液一次，以后每3天换液一次；

步骤7，终产物干细胞的预处理：将上述步骤6培养的干细胞和培养液一起吸至离心管，1000rpm 离心5分钟，弃上清；重悬细胞并用梯度吸管吹打，分散大的细胞团为单细胞或小的细胞团，按1:3～1:4传代；置37℃，5%CO₂，饱和湿度培养箱中培养6～8天，传代后第2天换液一次，以后每3天换液一次，即获得终产物干细胞；

步骤8，终产物干细胞的处理：将步骤7预处理后的终产物干细胞用浓度为0.25%的胰酶消化，用相当于5倍胰酶消化液体积的不含血清的培养液来终止消化，1000rpm离心5分钟，以步骤7所用的细胞培养基重悬离心沉淀后的终产物干细胞，混匀后装入注射瓶中，无菌密封，其中，干细胞的浓度是1×10⁶～1×10⁷个/ml；

步骤9：用免疫细胞化学染色法对所得终产物干细胞进行鉴定，主要标志物为神经元特异性烯醇化酶（NSE）、胶质纤维酸性蛋白（GFAP）和神经微管相关蛋白-2（MAP-2），且细胞NSE的表达率为90%以上，GFAP和MAP-2表达结果为阴性；

其中：步骤2中细胞培养瓶在细胞接种前用FBS进行包被，将FBS均匀浸润细胞培养瓶并置37℃，5%CO₂，饱和湿度培养箱孵育30分钟即为包被；

步骤2中原代细胞培养所用的完全培养基为含20% FBS，2ng/ml表皮细胞生长因子(EGF)，100U/ml青霉素，100μg/ml链霉素，25mM左旋谷氨酞胺(L-Glu)的F12完全培养液；

步骤3～4中传代细胞培养所用的完全培养基为含10% FBS，100 U/ml青霉素，100μg/ml链霉素的DMEM/F12完全培养液；

步骤5中细胞培养所用的完全培养基为含10%人AB血清、100 U/ml青霉素和100μg/ml链霉素的F12完全培养液，并添加了50ng/ml成纤维细胞生长因子（bFGF）、100ng/ml成纤维细胞生长因子 8（FGF8）、500ng/ml音猬因子（SHH）和10ng/ml白血病抑制因子（LIF）；

步骤6中细胞培养所用的完全培养基为含3% N2/B27，B27的成分为：2mmol/L L-谷氨酰胺、30nmol/L亚硒酸钠、20nmol/L孕酮、60μmol/L腐胺、100μg/ml转铁蛋白、25μg/ml胰岛素、质量分数为16%葡萄糖；N2的成分为：100μg/ml转铁蛋白、25μg/ml胰岛素、20nmol/L孕酮、60μmol/L腐胺、30nmol/L亚硒酸钠，100u/ml青霉素，100μg/ml链霉素的无血清neurobasalmedia，添加了50ng/ml bFGF，100ng/ml成纤维细胞生长因子（FGFs）和500ng/ml音猬因子（SHH）；

步骤7中细胞培养所用的完全培养基为含10～20ng/ml表皮细胞生长因子(EGF)，0.2～0.4mg/ml三磷酸胞苷二钠(CTP)，3～5 mmol/L氯化锂(LiCl)的F12细胞培养液，且不含酚红。