[发明专利]检测恩诺沙星残留的时间分辨荧光免疫分析试纸的制备方法

摘要

本发明涉及生物检测技术领域，公开了一种检测恩诺沙星Enro残留的时间分辨荧光免疫分析试纸的制备方法。它包括化学方法合成药物人工抗原以恩诺沙星为母核，通过化学方法合成人工免疫原；免疫BALB/c小鼠，通过杂交瘤技术，得到分泌抗恩诺沙星的单克隆抗体的杂交瘤细胞株；以体内诱生腹水法大量制备抗体，使用Protein G柱进行纯化，获得抗恩诺沙星的单克隆抗体；免疫时间分辨荧光的制备；恩诺沙星残留快速检测试纸条金标垫的制备、NC膜的包被、样品垫的制备及组装；本发明所制备的检测恩诺沙星Enro残留的时间分辨荧光免疫分析试纸灵敏度高、特异性强、稳定性好，具有结构简单、组装容易、耐腐蚀、重量轻、成本低、适用面广等特点，能够起到良好的堵水上色效果。

主权项

一种检测恩诺沙星残留的时间分辨荧光免疫分析试纸的制备方法，其特征在于：它包括以下步骤：步骤一、化学方法制备恩诺沙星药物人工抗原：采用N‑羟基琥珀酰亚胺法，将恩诺沙星、N‑羟基琥珀酰亚胺，以及碳二亚胺盐酸充分溶解于二甲基甲酰胺中，于室温下搅拌20~28h，即可得到恩诺沙星反应液，称取相应分量的牛血清白蛋白，使之充分溶解在pH=7.2的磷酸盐缓冲液中,将恩诺沙星反应液逐滴缓慢滴加到磷酸盐缓冲液中，并于室温下搅拌2~4h，然后用磷酸盐缓冲液透析3d，每天换透析液2次，以除去未反应的小分子物质；将溶液以20000r/min离心30min，收集上清，真空冷冻干燥即得偶合物Enro‑BSA白色粉末；步骤二、抗恩诺沙星单克隆抗体的制备：用步骤一所制备的偶合物Enro‑BSA免疫Balb/c小鼠，每只小鼠免疫三次后，分离免疫小鼠的脾细胞，并进行匀浆制备免疫脾细胞，再将免疫脾细胞与骨髓瘤细胞进行杂交，得到分泌抗恩诺沙星的单克隆抗体的杂交瘤细胞株，所述杂交瘤细胞株分泌的抗体亚型为IgG，以体内诱生腹水法大量制备抗体，使用ProteinG柱进行纯化，获得抗恩诺沙星的单克隆抗体IgG；采用辛酸‑硫酸铵法对小鼠腹水进行纯化后免疫健康新西兰大白兔，制备高效价的兔抗鼠IgG高免血清，采用饱和硫酸铵沉淀法对血清进行粗提，经葡聚糖凝胶G‑200过柱后得到高纯度的兔抗鼠IgG；步骤三、时间分辨荧光的制备：采用柠檬酸三钠还原法制备出粒直径为16~18nm的时间分辨荧光Eu3+；步骤四、免疫时间分辨荧光的制备：用步骤三制备的时间分辨荧光Eu3+作为标记物标记抗恩诺沙星单克隆抗体，试验选择出最佳标记的pH值为6.0，抗恩诺沙星单克隆抗体最佳标记量为每毫升时间分辨荧光Eu3+添加32.5μg抗恩诺沙星单克隆抗体，制备出经过时间分辨荧光Eu3+标记后的抗恩诺沙星单克隆抗体免疫时间分辨荧光；步骤五、恩诺沙星残留检测试纸条的制备：以NC膜作为固相载体，将恩诺沙星药物人工抗原包被在检测线T线处，兔抗鼠IgG包被在质控线C线处，经过时间分辨荧光Eu3+标记后的抗恩诺沙星单克隆抗体免疫时间分辨荧光包被在金标垫中，将吸水垫、NC膜、金标垫、样品垫依次重叠粘贴于PVC底板上，重叠处的宽度为0.9~1.1mm，将组装好的试纸板切割成试纸条后装入卡套中制得检测恩诺沙星残留的时间分辨荧光免疫分析试纸。