[发明专利]检测恩诺沙星残留的时间分辨荧光免疫分析试纸的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物检测技术领域，具体的说是涉及一种能够准确、快速、便捷地检测恩诺沙星Enro残留的时间分辨荧光免疫分析试纸的制备方法。

背景技术

恩诺沙星(Enrofloxacin)，简写为Enro,又名恩氟奎林羧酸，属于氟奎诺酮类(Fluoroquinolones)之化学合成抑菌剂，易溶于甲醇及氰甲烷等有机溶剂，是一类人畜通用的药物，因其具有抗菌谱广、抗菌活性强、与其他抗菌药物无交叉耐药性和毒副作用小等特点，被广泛应用于畜牧、水产等养殖业中，包括在鸡、鸭、鹅、猪、牛、羊、鱼、虾、蟹等的养殖中用于疾病防治。恩诺沙星近年来在食用动物饲养中的滥用越来越受到人们的重视，由于恩诺沙星药物在动物机体组织中的残留，人食用动物组织后就在人体内残留蓄积，造成人体疾病对该药物的严重耐药性，影响人体疾病的治疗。联合国粮农组织/世界卫生组织食品添加剂专家联席委员会、欧盟都已制定了恩诺沙星药物在动物组织中的最高残留限量。美国FDA于2005年宣布禁止用于治疗家禽细菌感染的抗菌药物恩诺沙星的销售和使用。

分析检测领域的研究者一直致力于研究开发恩诺沙星残留的快速、可靠、低成本的检测方法。目前检测恩诺沙星药物残留的方法有LC-UV、LC-MS、LC-MS-MS和LC-EIMS等，该类技术需要复杂昂贵的仪器设备及专业操作人员，加之样品前处理繁琐费时、检测费用高，难以满足高流通量、快速检测的需要。ELISA等免疫分析具有样品处理简单、特异性高、成本低和操作简单等优点，但也存在假阳性高、重复性差、酶易失去活性等缺点。

时间分辨荧光免疫层析方法是一种快速有效的兽药残留分析方法，该方法具有操作简单、快速，高效、高灵敏度，不需要专业人员操作，成本低、易推广等优点。因此在食品安全这个全球关注的热点问题中，为了快速准确地检测各种违禁兽药的残留，建立特异、灵敏和快速的分析方法已经成为科研工作者的一项紧急任务。

发明内容

本发明的目的是提供一种检测恩诺沙星残留的时间分辨荧光免疫分析试纸的制备方法，以解决检测食用动物体内恩诺沙星残留样品处理复杂，检测设备昂贵的问题。

为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案为：

一种检测恩诺沙星残留的时间分辨荧光免疫分析试纸的制备方法，它包括以下步骤：

步骤一、化学方法制备恩诺沙星药物人工抗原：采用N-羟基琥珀酰亚胺法，将恩诺沙星、N-羟基琥珀酰亚胺，以及碳二亚胺盐酸充分溶解于二甲基甲酰胺中，于室温下搅拌20~28h，即可得到恩诺沙星反应液，称取相应分量的牛血清白蛋白，使之充分溶解在pH=7.2的磷酸盐缓冲液中,将恩诺沙星反应液逐滴缓慢滴加到该牛血清白蛋白溶液中，并于室温下搅拌2~4h，然后用磷酸盐缓冲液透析3d，每天换透析液2次，以除去未反应的小分子物质；将溶液以20000r/min离心30min，收集上清，真空冷冻干燥即得偶合物Enro-BSA白色粉末；

步骤二、抗恩诺沙星克隆抗体的制备：用步骤一所制备的恩诺沙星药物人工抗原偶联物免疫Balb/c小鼠，每只小鼠免疫三次后，分离免疫小鼠的脾细胞，并进行匀浆制备免疫脾细胞，再将免疫脾细胞与骨髓瘤细胞进行杂交，得到分泌抗恩诺沙星的单克隆抗体的杂交瘤细胞株，所述杂交瘤细胞株分泌的抗体亚型为IgG；采用辛酸-硫酸铵法对小鼠腹水进行纯化后免疫健康新西兰大白兔，制备高效价的兔抗鼠IgG高免血清，采用饱和硫酸铵沉淀法对血清进行粗提，经葡聚糖凝胶G-200过柱后得到高纯度的兔抗鼠IgG；

步骤三、时间分辨荧光的制备：采用柠檬酸三钠还原法制备出粒直径为16~18nm的时间分辨荧光Eu³⁺；

步骤四、免疫时间分辨荧光的制备：用步骤三制备的时间分辨荧光Eu³⁺作为标记物标记恩诺沙星单克隆抗体，试验选择出最佳标记的pH值为6.0，最佳标记量为lmL，时间分辨荧光Eu³⁺标记恩诺沙星单克隆抗体为32.5μg，制备出经过时间分辨荧光Eu³⁺标记后的恩诺沙星单克隆抗体免疫时间分辨荧光；

步骤五、恩诺沙星残留检测试纸条的制备：以NC膜作为固相载体，将恩诺沙星人工抗原包被在检测线T线处，兔抗鼠IgG多克隆抗体包被在质控线C线处，免疫时间分辨荧光包被在金标垫中，将吸水垫、NC膜、金标垫、样品垫依次重叠粘贴于PVC底板上，重叠处的宽度为0.9~1.1mm，将组装好的试纸板切割成试纸条后装入卡套中制得检测恩诺沙星残留的时间分辨荧光免疫分析试纸；