[发明专利]检测恩诺沙星残留的时间分辨荧光免疫分析试纸的制备方法

权利要求书

1.一种检测恩诺沙星残留的时间分辨荧光免疫分析试纸的制备方法，其特征在于：它包括以下步骤：

步骤一、化学方法制备恩诺沙星药物人工抗原：采用N-羟基琥珀酰亚胺法，将恩诺沙星、N-羟基琥珀酰亚胺，以及碳二亚胺盐酸充分溶解于二甲基甲酰胺中，于室温下搅拌20~28h，即可得到恩诺沙星反应液，称取相应分量的牛血清白蛋白，使之充分溶解在pH=7.2的磷酸盐缓冲液中,将恩诺沙星反应液逐滴缓慢滴加到该牛血清白蛋白溶液中，并于室温下搅拌2~4h，然后用磷酸盐缓冲液透析3d，每天换透析液2次，以除去未反应的小分子物质；将溶液以20000r/min离心30min，收集上清，真空冷冻干燥即得偶合物Enro-BSA白色粉末；

步骤二、抗恩诺沙星克隆抗体的制备：用步骤一所制备的恩诺沙星药物人工抗原偶联物免疫Balb/c小鼠，每只小鼠免疫三次后，分离免疫小鼠的脾细胞，并进行匀浆制备免疫脾细胞，再将免疫脾细胞与骨髓瘤细胞进行杂交，得到分泌抗恩诺沙星的单克隆抗体的杂交瘤细胞株，所述杂交瘤细胞株分泌的抗体亚型为IgG；采用辛酸-硫酸铵法对小鼠腹水进行纯化后免疫健康新西兰大白兔，制备高效价的兔抗鼠IgG高免血清，采用饱和硫酸铵沉淀法对血清进行粗提，经葡聚糖凝胶G-200过柱后得到高纯度的兔抗鼠IgG；

步骤三、时间分辨荧光的制备：采用柠檬酸三钠还原法制备出粒直径为16~18nm的时间分辨荧光Eu³⁺；

步骤四、免疫时间分辨荧光的制备：用步骤三制备的时间分辨荧光Eu³⁺作为标记物标记恩诺沙星单克隆抗体，试验选择出最佳标记的pH值为6.0，最佳标记量为lmL，时间分辨荧光Eu³⁺标记恩诺沙星单克隆抗体为32.5μg，制备出经过时间分辨荧光Eu³⁺标记后的恩诺沙星单克隆抗体免疫时间分辨荧光；

步骤五、恩诺沙星残留检测试纸条的制备：以NC膜作为固相载体，将恩诺沙星人工抗原包被在检测线T线处，兔抗鼠IgG多克隆抗体包被在质控线C线处，免疫时间分辨荧光包被在金标垫中，将吸水垫、NC膜、金标垫、样品垫依次重叠粘贴于PVC底板上，重叠处的宽度为0.9~1.1mm，将组装好的试纸板切割成试纸条后装入卡套中制得检测恩诺沙星残留的时间分辨荧光免疫分析试纸。

2.根据权利要求1所述的所述检测恩诺沙星残留的时间分辨荧光免疫分析试纸的制备方法，其特征在于：所制得的检测恩诺沙星残留的时间分辨荧光免疫分析试纸100%抑制浓度为500ng/mL。

3.根据权利要求1或2所述的检测恩诺沙星残留的时间分辨荧光免疫分析试纸的制备方法，其特征在于：所述检测恩诺沙星残留的时间分辨荧光免疫分析试纸包括卡套、试纸条，试纸条包括依次重叠粘贴在PVC底板上的吸水垫、NC膜、金标垫、样品垫，NC膜上设有两条包被线，一条线包被着所述步骤二所制备的抗恩诺沙星克隆抗体兔抗鼠IgG作为质控线C线，另一条线包被着所述步骤一制得的恩诺沙星药物人工抗原作为检测线T线；金标垫上包被有步骤四所制备的经过超低温冷冻干燥固化后的免疫时间分辨荧光作为示踪物。

4.根据权利要求3所述的检测恩诺沙星残留的时间分辨荧光免疫分析试纸的制备方法，其特征在于：所述卡套的外壁上设有观察孔、点样孔，观察孔位于所述质控线C线和检测线T线的上方，点样孔位于样品垫的上方。

5.根据权利要求3所述的检测恩诺沙星残留的时间分辨荧光免疫分析试纸的制备方法，其特征在于：所述NC膜型号为Millipore135。