[发明专利]一种鸡蛋清溶菌酶基因（RJM）的克隆及其酵母表达方法

摘要

本发明属于生物基因工程领域，公开了一种鸡蛋清溶菌酶基因(RJM)的克隆及其酵母表达方法，通过获取鸡蛋清溶菌酶基因(RJM)、测定溶菌酶基因核酸序列及氨基酸序列、构建基因表达载体、鉴定基因表达载体、将酵母表达质粒转化入酵母细胞、诱导表达鸡蛋清溶菌酶及免疫印迹实验验证实现鸡蛋清溶菌酶基因(RJM)的克隆及其酵母表达。本发明可以高密度发酵酵母，大量表达鸡蛋清溶菌酶基因，由于酵母菌属于真核微生物，表达出的溶菌酶蛋白对其无杀伤作用，可有效避免原核微生物表达过程中溶菌酶蛋白对工程菌的杀伤，本发明属于分泌表达，易于获取目的蛋白，可简化操作步骤，与化学合成目的蛋白相比，本发明具有节约成本的优点。

主权项

一种鸡蛋清溶菌酶基因(RJM)的克隆及其酵母表达方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤1：获取鸡蛋清溶菌酶基因(RJM)利用Primer引物设计软件设计一对引物，利用该引物合成鸡蛋清溶菌酶基因(RJM)序列，合成的溶菌酶‑F的序列如序列表1所示，其中序列表1中划线部分的CTCGA为XhoⅠ酶切位点，合成的溶菌酶‑R的序列如序列表2所示，其中序列表2中划线部分的TCTAGA为XbaⅠ酶切位点；经RT‑PCR扩增、PCR反应获得鸡蛋清溶菌酶基因(RJM)；步骤2：测定溶菌酶基因核酸序列及氨基酸序列将步骤1中经RT‑PCR扩增、PCR反应获得鸡蛋清溶菌酶基因(RJM)连接到T载体，转化至大肠杆菌DH5α中进行序列的测定；步骤3：构建基因表达载体采用酶切连接的方法分别利用限制性内切酶SacII和XbaI双酶切重组质粒PMD19‑T‑RJM和酵母表达载体pPICZαA连接，利用胶回收试剂盒分别回收酶切产物，将连接产物分别转化新鲜制备的E.coli JM109感受态细胞，取经过冰浴、热休克及抗性复苏的菌液涂布于含ZeocinTM(25μg/ml)的低盐LB固体培养基平板上，于37℃温箱中倒置培养18～24h；步骤4：鉴定基因表达载体挑选步骤3中的菌落培养后，提取质粒进行XbaI和HindIII双酶切反应鉴定，如图1和图2所示，琼脂糖凝胶电泳中出现3200bp和750bp左右的片段，说明已经成功构建了溶菌酶基因的酵母表达质粒，将其命名为pPICZαA‑RJM；步骤5：将酵母表达质粒转化入酵母细胞挑取YPD平板上X33单菌落制备X33酵母感受态细胞，取10ul线性化的单拷贝质粒pPICZαA‑RJM，加入X33感受态细胞并轻轻混匀，经电转化获得饱满的单克隆，挑取单克隆至3ml含100μg/ml zeocin的YPD培养基中，待重组菌长起来后，利用酵母基因组DNA快速抽提试剂盒提取基因组，并对表达菌株X33/pPICZαA‑RJM进行PCR鉴定；步骤6：诱导表达鸡蛋清溶菌酶利用甲醇诱导X33酵母高效表达鸡蛋清溶菌酶；步骤7：免疫印迹实验验证利用兔抗6×His血清为一抗，HRP标记的山羊抗兔血清为二抗进行免疫印迹。