[发明专利]一种鸡蛋清溶菌酶基因（RJM）的克隆及其酵母表达方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种基因的克隆及其酵母表达方法，尤其是一种鸡蛋清溶菌酶基因(RJM)的克隆及其酵母表达方法，属于生物基因工程领域。

背景技术

溶菌酶(Lysozyme)是一种能水解致病菌中粘多糖的碱性酶，其化学名称为N-乙酰胞壁质聚糖水解酶，专门作用于微生物细胞壁的水解酶,又称细胞壁溶解酶。溶菌酶广泛存在于鸟类和家禽的蛋清中，其也广泛存在于哺乳动物的泪液、唾液、血浆、尿、乳汁、白细胞及其它体液(如淋巴液)和组织(如肝、肾)细胞内，其中蛋清中含量最丰富，多数商品溶菌酶是由蛋清中提取纯化的。鉴于抗生素的使用会带来畜禽产品药物残留、耐药基因转移等负面作用，近年来许多国家包括我国开始逐步限制使用饲用抗生素，因此研发新型、安全、高效的抗生素替代品迫在眉睫。溶菌酶因其优良的理化性质符合人们对食品安全性的需求，同时具有抗菌的活性，在新型添加剂产品研发中具有重要的地位。

鸡蛋清溶菌酶是使用和研究最广泛的一种，作为一种无毒、无副作用的天然蛋白质，在食品防腐、保鲜，医疗保健等方面己经成功应用，鸡蛋清溶菌酶的有效杀菌能力使其在替代抗生素、作为抗生素辅助制剂或者作为新型饲料添加剂等方面有着广阔的前景。过去，蛋清溶菌酶都是从鸡蛋清中提取，但因原料来源受限和含量较少，提取纯化过程步骤繁琐，产量低，成本高，无法大量获取。若采用化学合成方法成本昂贵，极大的限制了其在畜牧等低附加值行业中的应用。与此相比，若采用基因工程的方法来合成溶菌酶，则具有操作简单、成本廉价、重复性好、能大量获取、实现工业化生产的特点，有着广阔的市场应用前景。

利用基因工程的方法表达外源蛋白质目前主要有原核表达和真核表达两种主要的方式，原核表达是将外源基因转化到低等的原核微生物中进行表达，其步骤比较繁琐，而且通常表达的蛋白不能够进行正确的空间折叠而丧失活性，需要变性和复性处理；而真核表达系统能有效的避免上述问题，巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)表达系统是近年来应用最广泛的一种甲醇营养型表达系统。

常用的酵母表达载体pPIZα-A,B,C为含有醇氧化酶(AOX)启动子的整合载体，基因中含有与酵母染色体区同源的序列，通过同源重组而将外源基因整合于酵母染色体中。这样的表达系统具有继代稳定，可以高密度发酵，在发酵过程中自身分泌的蛋白少，外源蛋白表达量高等优点，而且在其分泌表达溶菌酶时自身不受其杀菌活性的影响，还能保证溶菌酶分子的正确结构和适度的糖基化，从而保证其天然活性，是一种高效蛋白表达体系。目前，鸡蛋清溶菌酶(RJM)未见有酵母系统成功表达的报道。

发明内容

本发明的主要目的是为了解决上述方法中的缺陷，提供一种可以高密度发酵酵母、大量表达鸡蛋清溶菌酶基因、并可以有效避免原核微生物表达过程中溶菌酶蛋白对工程菌杀伤的一种鸡蛋清溶菌酶基因(RJM)的克隆及其酵母表达方法。

本发明的目的是通过采用如下技术方案达到的：

一种鸡蛋清溶菌酶基因(RJM)的克隆及其酵母表达方法，包括如下步骤：

步骤1：获取鸡蛋清溶菌酶基因(RJM)

利用Primer引物设计软件设计一对引物，合成鸡蛋清溶菌酶基因(RJM)序列，合成的溶菌酶-F的序列如序列表1所示，其中序列表1中划线部分的CTCGA为XhoⅠ酶切位点，合成的溶菌酶-R的序列如序列表2所示，其中序列表2中划线部分的TCTAGA为XbaⅠ酶切位点；经RT-PCR扩增、PCR反应获得鸡蛋清溶菌酶基因(RJM)；

步骤2：测定溶菌酶基因核酸序列及氨基酸序列

将步骤1中经RT-PCR扩增、PCR反应获得鸡蛋清溶菌酶基因(RJM)连接到T载体，转化至大肠杆菌DH5α中进行序列的测定；

步骤3：构建基因表达载体

采用酶切连接的方法分别利用限制性内切酶SacII和XbaI双酶切重组质粒PMD19-T-RJM和酵母表达载体pPICZαA连接，利用胶回收试剂盒分别回收酶切产物，将连接产物分别转化新鲜制备的E.coli JM109感受态细胞，取经过冰浴、热休克及抗性复苏的菌液涂布于含ZeocinTM(25μg/ml)的低盐LB固体培养基平板上，于37℃温箱中倒置培养18～24h；

步骤4：鉴定基因表达载体

挑选步骤3中的菌落培养后，提取质粒进行XbaI和HindIII双酶切反应鉴定，如图1和图2所示，琼脂糖凝胶电泳中出现3200bp和750bp左右的片段，说明已经成功构建了溶菌酶基因的酵母表达质粒，将其命名为pPICZαA-RJM；

步骤5：将酵母表达质粒转化入酵母细胞