[发明专利]一种鸡蛋清溶菌酶基因（RJM）的克隆及其酵母表达方法

权利要求书

1.一种鸡蛋清溶菌酶基因(RJM)的克隆及其酵母表达方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤1：获取鸡蛋清溶菌酶基因(RJM)

利用Primer引物设计软件设计一对引物，利用该引物合成鸡蛋清溶菌酶基因(RJM)序列，合成的溶菌酶-F的序列如序列表1所示，其中序列表1中划线部分的CTCGA为XhoⅠ酶切位点，合成的溶菌酶-R的序列如序列表2所示，其中序列表2中划线部分的TCTAGA为XbaⅠ酶切位点；经RT-PCR扩增、PCR反应获得鸡蛋清溶菌酶基因(RJM)；

步骤2：测定溶菌酶基因核酸序列及氨基酸序列

将步骤1中经RT-PCR扩增、PCR反应获得鸡蛋清溶菌酶基因(RJM)连接到T载体，转化至大肠杆菌DH5α中进行序列的测定；

步骤3：构建基因表达载体

采用酶切连接的方法分别利用限制性内切酶SacII和XbaI双酶切重组质粒PMD19-T-RJM和酵母表达载体pPICZαA连接，利用胶回收试剂盒分别回收酶切产物，将连接产物分别转化新鲜制备的E.coli JM109感受态细胞，取经过冰浴、热休克及抗性复苏的菌液涂布于含ZeocinTM(25μg/ml)的低盐LB固体培养基平板上，于37℃温箱中倒置培养18～24h；

步骤4：鉴定基因表达载体

挑选步骤3中的菌落培养后，提取质粒进行XbaI和HindIII双酶切反应鉴定，如图1和图2所示，琼脂糖凝胶电泳中出现3200bp和750bp左右的片段，说明已经成功构建了溶菌酶基因的酵母表达质粒，将其命名为pPICZαA-RJM；

步骤5：将酵母表达质粒转化入酵母细胞

挑取YPD平板上X33单菌落制备X33酵母感受态细胞，取10ul线性化的单拷贝质粒pPICZαA-RJM，加入X33感受态细胞并轻轻混匀，经电转化获得饱满的单克隆，挑取单克隆至3ml含100μg/ml zeocin的YPD培养基中，待重组菌长起来后，利用酵母基因组DNA快速抽提试剂盒提取基因组，并对表达菌株X33/pPICZαA-RJM进行PCR鉴定；

步骤6：诱导表达鸡蛋清溶菌酶

利用甲醇诱导X33酵母高效表达鸡蛋清溶菌酶；

步骤7：免疫印迹实验验证

利用兔抗6×His血清为一抗，HRP标记的山羊抗兔血清为二抗进行免疫印迹。

2.根据权利要求1所述的一种鸡蛋清溶菌酶基因(RJM)的克隆及其酵母表达方法，其特征在于：所述步骤1中RT-PCR扩增的反转录反应体系为：

总计10μL样品经

3.根据权利要求1所述的一种鸡蛋清溶菌酶基因(RJM)的克隆及其酵母表达方法，其特征在于：所述步骤1中PCR反应为：

向所述反转录反应结束后的反应管中再加入下列试剂：

总量为50μL，轻轻混匀后短暂离心，按以下条件进行PCR反应：

4℃保存。

4.根据权利要求1所述的一种鸡蛋清溶菌酶基因(RJM)的克隆及其酵母表达方法，其特征在于：所述步骤2中测定的序列如序列表3所示，鸡蛋清溶菌酶基因ORF碱基长度为357bp，编码118个氨基酸。

5.根据权利要求1所述的一种鸡蛋清溶菌酶基因(RJM)的克隆及其酵母表达方法，其特征在于：所述步骤3中的酶切反应体系为：

6.根据权利要求1所述的一种鸡蛋清溶菌酶基因(RJM)的克隆及其酵母表达方法，其特征在于：所述步骤3中的连接体系为：

先将目的片段与pPICZαA载体片段混合均匀，45℃作用5min，短暂离心混匀后，16℃连接12h。