[发明专利]一种可用于胚胎注射制备敲除小鼠的Cas9蛋白的制备方法

摘要

本发明公开了一种可用于胚胎注射制备敲除小鼠的Cas9蛋白的制备方法，将Cas9蛋白序列转化入pET28a‑ccdB‑CmR载体，再转化至原核表达菌株，经过诱导表达后，收集菌体，经亲和纯化、用超滤管浓缩纯化、透析后即得到纯化的Cas9蛋白；所述pET‑28‑ccdB‑CmR载体是以原核表达载体pET28a基础，在Hind III和Xho I酶切位点之间插入NotI‑ccdB‑CmR‑AscI序列得到。本发明构建了高效的Cas9蛋白原核表达系统，表达得到的Cas9蛋白经体外切割实验证明具有体外活性，可特异切割体外DNA；胚胎注射实验证明纯化的Cas9蛋白具有体内活性，可用于制备基因修饰动物。

主权项

1.一种可用于胚胎注射制备敲除小鼠的Cas9蛋白的制备方法，其特征在于，步骤如下：S1.以携带有Cas9序列的px330质粒为模版，利用SEQ ID NO.1和2所示上下游引物进行PCR扩增；S2.利用Not I和Asc I双酶切，将PCR扩增产物连接至pET28a‑ccdB‑CmR载体，得到重组质粒pET‑28a‑Cas9；S3.重组质粒pET‑28a‑Cas9转化至BL21表达菌株，菌株用终浓度为0.2mM的IPTG，于15℃诱导表达24h；S4.纯化：利用Ni Sepharose FF进行纯化；S5.浓缩：纯化后的Cas9蛋白再以100kDa超滤管浓缩，浓缩后蛋白加入透析液，以30kDa透析袋进行透析，透析后得到的Cas9蛋白添加甘油至终浓度50%后，分装液氮速冻保存于‑80℃；其中，步骤S2所述pET‑28‑ccdB‑CmR载体是以原核表达载体pET28a基础，在Hind III和XhoI酶切位点之间插入NotI‑ccdB‑CmR‑AscI序列得到。