[发明专利]一种可用于胚胎注射制备敲除小鼠的Cas9蛋白的制备方法

权利要求书

1.一种可用于胚胎注射制备敲除小鼠的Cas9蛋白的制备方法，其特征在于，步骤如下：

S1.以携带有Cas9序列的px330质粒为模版，利用SEQ ID NO.1和2所示上下游引物进行PCR扩增；

S2.利用Not I和Asc I双酶切，将PCR扩增产物连接至pET28a-ccdB-CmR载体，得到重组质粒pET-28a-Cas9；

S3.重组质粒pET-28a-Cas9转化至BL21表达菌株，菌株用终浓度为0.2mM的IPTG，于15℃诱导表达24h；

S4.纯化：利用Ni Sepharose FF进行纯化；

S5.浓缩：纯化后的Cas9蛋白再以100kDa超滤管浓缩，浓缩后蛋白加入透析液，以30kDa透析袋进行透析，透析后得到的Cas9蛋白添加甘油至终浓度50%后，分装液氮速冻保存于-80℃；

其中，步骤S2所述pET-28-ccdB-CmR载体是以原核表达载体pET28a基础，在Hind III和XhoI酶切位点之间插入NotI-ccdB-CmR-AscI序列得到。

2.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，所述诱导表达的条件为：按照1：100的接种量，将表达菌接种LB培养基培养，于37℃过夜培养菌种至OD600=1.0，冰上冷却30分钟后，加终浓度为0.2mM的IPTG，于15℃继续培养24小时。

3.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，纯化蛋白时，使用50mM Tris-HCl、pH8.0300mM、NaCl 10%甘油和40mM咪唑组成的裂解缓冲液进行菌体裂解。

4.根据根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，纯化蛋白时，以50mM Tris-HCl、pH8.0 300mM NaCl、10%甘油和250mM咪唑组成的洗脱缓冲液进行洗脱。

5.根据根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，纯化蛋白时，以30kDa透析袋于50mMTris-HCl、pH8.0 300mM NaCl和10%甘油组成的透析液中进行透析。