[发明专利]一种可用于胚胎注射制备敲除小鼠的Cas9蛋白的制备方法

说明书

本发明公开了一种可用于胚胎注射制备敲除小鼠的Cas9蛋白的制备方法，将Cas9蛋白序列转化入pET28a‑ccdB‑CmR载体，再转化至原核表达菌株，经过诱导表达后，收集菌体，经亲和纯化、用超滤管浓缩纯化、透析后即得到纯化的Cas9蛋白；所述pET‑28‑ccdB‑CmR载体是以原核表达载体pET28a基础，在Hind III和Xho I酶切位点之间插入NotI‑ccdB‑CmR‑AscI序列得到。本发明构建了高效的Cas9蛋白原核表达系统，表达得到的Cas9蛋白经体外切割实验证明具有体外活性，可特异切割体外DNA；胚胎注射实验证明纯化的Cas9蛋白具有体内活性，可用于制备基因修饰动物。

技术领域

本发明属于蛋白质技术领域。更具体地，涉及一种可用于胚胎注射制备敲除小鼠的Cas9蛋白的制备方法。

背景技术

对于临床疾病的研究，由于很难在临床病人身上实现各种控制变量的实验，或者由于某种疾病成因差异较大、病程进展不一或疾病十分罕见，了解疾病发生进展机理以及寻找治疗手段一般都需要建立相应的实验动物模型。另外，当我们想研究某个基因在生物体中的生理功能时，也需要建立一定的实验动物模型，并从多方面考察该基因的功能。因此，基因编辑（genome editing）技术在建立动物疾病模型和研究基因功能中有着十分重要的地位。基因编辑技术包括了最早的依赖同源重组编辑、锌指核酸酶（Zinc FingerNuclease）、TALE核酸酶（Transcription activator like effector nucleases, TALENs）到最新的CRISPR （clustered regularly interspaced short palindromic repeats）/Cas（CRISPR-associated）系统。除了最先的依赖同源重组编辑以外，其余三种基因编辑系统均能在双链DNA上制造双链DNA断裂（Double Strand Breaks，DSB）。双链DNA断裂产生后可通过同源重组（Homologous Recombination，HR）或非同源末端连接（Non-HomologousEnd Joining，NHEJ）被重新修复。单独导入这些核酸酶，通过非同源末端连接可造成基因组特点位点的插入或缺失，有机会造成目标基因的移码，使目标蛋白失去正常功能；同时将这类核酸酶和修复模版导入细胞，通过同源重组有机会将基因组中序列替换为修复模版序列，产生人为的定向突变。