[发明专利]一种基于金磁微粒的吖啶酯化学发光免疫学检测HE4的方法

摘要

本发明提供了一种基于金磁微粒的吖啶酯化学发光免疫学检测人附睾分泌蛋白4(HE4)的方法，主要包括以下步骤(1)以金磁微粒作为免疫反应和固相分离的载体，将HE4包被抗体偶联在金磁微粒的表面；(2)用封闭液封闭金磁微粒表面未与HE4包被抗体结合的空白位点；(3)用吖啶酯(AE)对HE4标记抗体进行标记；(4)将待检样品和能与HE4抗原发生特异性结合吖啶酯标记的HE4抗体加入封闭后的包被有HE4抗体的金磁微粒中进行反应，形成双抗体夹心复合物；(5)清洗；(6)化学发光检测。本发明检测灵敏度高、特异性好、线性范围宽、精密度高、稳定性好、无放射性污染、操作安全、方法简便快速。

主权项

一种基于金磁微粒的吖啶酯化学发光免疫学检测HE4的方法，用于非疾病诊断目的，包括以下步骤：(1)包被以金磁微粒作为免疫反应和固相分离的载体，将HE4包被抗体偶联在金磁微粒的表面；具体过程如下：(1.1)预处理:取金磁微粒，用平衡缓冲液清洗平衡1～3遍；(1.2)偶联:将HE4包被抗体与偶联缓冲液混合，将所得混合液加入经过预处理的金磁微粒中，置于摇床，在25‑40℃，150～250rpm条件下充分反应，反应完后，置于磁性分离器上，磁性分离，弃上清；(1.3)清洗:用清洗缓冲液清洗3‑5次，磁性分离，弃上清；(2)封闭在步骤(1)的产物中加入封闭液，置于摇床中，在25‑40℃条件下，以150～250rpm的转速反应1～2小时，封闭金磁微粒表面未与HE4包被抗体结合的空白位点；然后磁性分离，弃上清，用清洗缓冲液清洗后悬于保存缓冲液中保存备用；(3)抗体的标记(3.1)预处理：用洗脱缓冲液对脱盐柱进行平衡；(3.2)抗体标记：取吖啶酯溶液和HE4标记抗体溶液，用标记缓冲液混合，置于摇床中，在20‑25℃条件下，以150～250rpm的转速反应10～30分钟；加入赖氨酸盐溶液，再次置于摇床中，在20‑25℃条件下，以150～250rpm的转速反应20～50分钟；HE4抗体标记采用的标记物是吖啶酯类化学发光物质，吖啶酯溶液浓度为0.05‑1mM，HE4标记抗体的投入量为50‑500μg；(3.3)纯化收集:将步骤(3.2)反应得到的抗体溶液上样脱盐柱，用洗脱缓冲液进行洗脱收集，通过收集物的发光值和抗体浓度筛选抗体纯化产物，即标记有吖啶酯的HE4抗体；(4)与待测物结合将待检样品和能与HE4抗原发生特异性结合的标记有吖啶酯的HE4抗体，加入经过步骤(2)封闭后的结合有HE4包被抗体的金磁微粒中进行反应，待测样品中所含的HE4抗原被金磁微粒上的HE4包被抗体捕获，同时与吖啶酯标记HE4抗体结合，形成“双抗体夹心复合物”；(5)清洗用清洗缓冲液清洗双抗体夹心复合物，磁性分离，弃上清；(6)化学发光检测向经过步骤(5)处理后形成的双抗体夹心复合物中加入化学发光底物液，在化学发光底物液加入后立即测定待测各孔的发光强度；发光强度与待测样本的浓度成正比关系；所述化学发光底物包括使用前独立存在的发光激发液A和发光激发液B，其中发光激发液A中含有0.1％双氧水、0.05‑0.5M硝酸，发光激发液B中含有0.25M氢氧化钠、0.5％‑5％的曲拉通‑100。