[发明专利]一种基于金磁微粒的吖啶酯化学发光免疫学检测HE4的方法

权利要求书

1.一种基于金磁微粒的吖啶酯化学发光免疫学检测HE4的方法，用于非疾病诊断目的，包括以下步骤：

(1)包被

以金磁微粒作为免疫反应和固相分离的载体，将HE4包被抗体偶联在金磁微粒的表面；具体过程如下：

(1.1)预处理:取金磁微粒，用平衡缓冲液清洗平衡1～3遍；

(1.2)偶联:将HE4包被抗体与偶联缓冲液混合，将所得混合液加入经过预处理的金磁微粒中，置于摇床，在25-40℃，150～250rpm条件下充分反应，反应完后，置于磁性分离器上，磁性分离，弃上清；

(1.3)清洗:用清洗缓冲液清洗3-5次，磁性分离，弃上清；

(2)封闭

在步骤(1)的产物中加入封闭液，置于摇床中，在25-40℃条件下，以150～250rpm的转速反应1～2小时，封闭金磁微粒表面未与HE4包被抗体结合的空白位点；然后磁性分离，弃上清，用清洗缓冲液清洗后悬于保存缓冲液中保存备用；

(3)抗体的标记

(3.1)预处理：用洗脱缓冲液对脱盐柱进行平衡；

(3.2)抗体标记：取吖啶酯溶液和HE4标记抗体溶液，用标记缓冲液混合，置于摇床中，在20-25℃条件下，以150～250rpm的转速反应10～30分钟；加入赖氨酸盐溶液，再次置于摇床中，在20-25℃条件下，以150～250rpm的转速反应20～50分钟；HE4抗体标记采用的标记物是吖啶酯类化学发光物质，吖啶酯溶液浓度为0.05-1mM，HE4标记抗体的投入量为50-500μg；

(3.3)纯化收集:将步骤(3.2)反应得到的抗体溶液上样脱盐柱，用洗脱缓冲液进行洗脱收集，通过收集物的发光值和抗体浓度筛选抗体纯化产物，即标记有吖啶酯的HE4抗体；

(4)与待测物结合

将待检样品和能与HE4抗原发生特异性结合的标记有吖啶酯的HE4抗体，加入经过步骤(2)封闭后的结合有HE4包被抗体的金磁微粒中进行反应，待测样品中所含的HE4抗原被金磁微粒上的HE4包被抗体捕获，同时与吖啶酯标记HE4抗体结合，形成“双抗体夹心复合物”；

(5)清洗

用清洗缓冲液清洗双抗体夹心复合物，磁性分离，弃上清；

(6)化学发光检测

向经过步骤(5)处理后形成的双抗体夹心复合物中加入化学发光底物液，在化学发光底物液加入后立即测定待测各孔的发光强度；发光强度与待测样本的浓度成正比关系；所述化学发光底物包括使用前独立存在的发光激发液A和发光激发液B，其中发光激发液A中含有0.1％双氧水、0.05-0.5M硝酸，发光激发液B中含有0.25M氢氧化钠、0.5％-5％的曲拉通-100。