[发明专利]一种基于金磁微粒的吖啶酯化学发光免疫学检测HE4的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种检测人附睾分泌蛋白4(HE4)的方法。

背景技术

目前市场上对HE4蛋白的免疫学检测方法主要包括酶联免疫分析法、电化学发光法和化学发光酶免疫测定法等。酶联免疫分析法可用于定量检测，但操作步骤繁琐，受人为因素影响大，在灵敏度、特异性和应用范围上差别很大；电化学发光法定量检测的准确度较高，水平具有定量和稳定的优点，但是不适合于现代自动免疫仪器，需要专门的配套仪器使用，投资成本较高、因此难以推广应用；化学发光酶免疫测定法灵敏度和准确性要普遍高于酶联免疫法，同时对检测仪器设备的要求又远低于电化学发光法，所以一直受到广泛关注，但由于该类化学发光物质需要相应酶类进行催化发光，导致背景高灵敏度略低，此外酶催化的化学发光达到平台期需要一定时间，限制了检测效率。

化学发光免疫分析技术，是一项集中了多种免疫标记检测技术优点的免疫学检测技术，于1977年由Halmann等在经典放射性免疫分析技术的基础上创立而来。该检测技术包括两个主要系统，其中在继承了抗原抗体高特异性免疫反应系统的基础上，结合了化学发光系统，以化学发光物质作为标记物直接标记抗体或抗原，或是以能催化化学发光物质的酶作为标记物，在免疫反应后，化学发光物质在相应的氧化剂或催化酶存在的环境下，形成不稳定的中间体激发态，在回到基态时迅速释放可被化学发光仪检测到的光子信号，实现对待测抗原抗体复合物的准确定性或定量测定。其中以化学发光物质吖啶酯直接作为标记物，具有比酶催化化学发光更高的信号值和检测灵敏度。

传统的化学发光免疫分析大多以微孔板作为固相载体连接抗原或抗体，吖啶酯快速集中的发光特性使免疫分析过程更易实现自动化，便对固相载体有进一步要求。磁性微粒作为更加高效的抗原、抗体免疫反应固相载体，是一种在外磁场存在的条件下具有响应性的磁性金属或金属氧化物，大多以氧化铁为核心，经过分子修饰可以在其表面固定大量生物分子。此外磁性微粒的超顺磁性使其在外加磁场存在的情况下能够迅速聚集，而去掉外磁场后又能够重新悬浮分散于溶液中，极大缩短免疫检测操作过程中的清洗时间。

胶体金是一种具有一定大小，由静电作用形成的稳定胶体状态的金颗粒，很早就被用于生物分子的标记和检测。

结合磁性纳米粒子的超顺磁性和胶体金表面生物分子可修饰性的双重特质，发明人所在研究组研制了Fe₃O₄/Au磁性复合微粒，即金磁微粒，并将其实现了商业化。金磁微粒是一种新型磁性无机物复合微粒，这种材料兼有磁性粒子在外磁场中的可分离性以及磁颗粒表面修饰后对生物分子的快速固定化等特点，在生物与医学领域具有重要的应用前景。

基于磁性微粒的化学发光免疫分析法是将磁分离技术、免疫分析技术及化学发光检测技术三者有效结合在一起的新型的分析检测技术，因而具有化学发光的高灵敏度、免疫分析的强特异性、磁分离系统的快速分离的特点，此外，还具有检测时间短、线性范围宽、以及易实现自动化等优点，因此，近年来被广泛应用于临床诊断、生物医学、食品安全及毒品检测等众多方面。

对于特定的检测对象，基于磁性微粒(包括金磁微粒)的(吖啶酯化学发光)免疫分析法的建立需要进行大量的实验和分析研究才有可能取得有意义的成果。这主要是因为不同检测对象的分子结构、分子量、生物活性以及稳定的保存环境等都不相同。建立该方法的难点和复杂之处在于，不同检测对象对检测方法、免疫反应条件、甚至检测体系中的各个成分配比、发光液成分等都有着不同的要求，通过大量实验确定最优的结果才能达到最佳检测范围和灵敏度；在磁性分离过程中不同磁场强度或磁分离时间都直接影响分离效果；此外在抗体标记过程中，不同抗体甚至不同抗体用量，都直接影响标记体系结果的好坏(主要体现在标记效率)，标记反应条件、纯化收集的条件、保存条件等都需要反复设计实验来确定。

发明内容

本发明提供了一种基于金磁微粒的吖啶酯化学发光免疫学检测人附睾分泌蛋白4(HE4)的方法，以解决上述背景技术检测HE4存在的局限性、特异性、灵敏性、危险性等问题。

为实现上述发明目的，本发明给出以下解决方案：

基于金磁微粒的吖啶酯化学发光免疫学检测人附睾分泌蛋白4(HE4)的方法，包括以下步骤:

(1)包被

以金磁微粒作为免疫反应和固相分离的载体，将HE4包被抗体偶联在金磁微粒的表面；具体过程如下：

(1.1)预处理:取金磁微粒，用平衡缓冲液清洗平衡1～3遍；