[发明专利]基于CRISPR/Cas9系统靶向敲除KHV基因的敲除载体构建方法及其crRNA原件

摘要

基于CRISPR/Cas9系统靶向敲除KHV基因的敲除载体构建方法及其crRNA原件，涉及一种敲除载体构建方法及其crRNA原件。是要解决现有方法抑制KHVD不足的问题。方法：一、合成crRNA-TK和crRNA-DP引物，沸水处理，退火，得到两个DNA双链退火产物；二、制备pX330-puro载体；三、对pX330-puro载体进行酶切，进行去磷反应，回收线性化的载体；四、对线性化载体与两个退火产物连接，得连接产物；五、将连接产物转入感受态细胞内，提取重组质粒DNA，命名为pX330-puro TK或pX330-puro DP重组载体。本发明基于定向敲除KHV关键基因，靶向精确性高，胞内病毒抑制效果明显。

主权项

基于CRISPR/Cas9系统靶向敲除KHV基因的敲除载体构建方法，其特征在于该方法按以下步骤进行：一、依据KHV基因组TK和DP基因设计crRNAs，分别合成crRNA‑TK引物和crRNA‑DP引物，于沸水处理15min，而后自然降温过夜退火，分别得到两个带有BbsI酶切粘性末端的DNA双链退火产物；二、对能够携带CRISPR/Cas9的pX330载体进行了改造，成功制备了含有puromycin抗性基因的pX330‑puro载体；三、对pX330‑puro载体采用BbsI进行单酶切，而后采用SAP磷酸酶进行去磷反应，回收线性化的pX330‑puro载体；四、采用T4连接酶，对步骤三回收得到的线性化的pX330‑puro载体与步骤一得到的两个退火产物分别进行连接，得连接产物；五、将步骤四的连接产物转入感受态细胞内，培养后，挑取单菌落进行PCR验证，对PCR验证为阳性的单菌落，提取重组质粒DNA，对重组质粒DNA采用BbsI酶进行单酶切验证，对验证为阳性的重组质粒DNA，命名为pX330‑puro TK或pX330‑puro DP重组载体。