[发明专利]基于CRISPR/Cas9系统靶向敲除KHV基因的敲除载体构建方法及其crRNA原件

权利要求书

1.基于CRISPR/Cas9系统靶向敲除KHV基因的敲除载体构建方法，其特征在于该方法按以下步骤进行：

一、依据KHV基因组TK和DP基因设计crRNAs，分别合成crRNA-TK引物和crRNA-DP引物，于沸水处理15min，而后自然降温过夜退火，分别得到两个带有BbsI酶切粘性末端的DNA双链退火产物；

二、对能够携带CRISPR/Cas9的pX330载体进行了改造，成功制备了含有puromycin抗性基因的pX330-puro载体；

三、对pX330-puro载体采用BbsI进行单酶切，而后采用SAP磷酸酶进行去磷反应，回收线性化的pX330-puro载体；

四、采用T4连接酶，对步骤三回收得到的线性化的pX330-puro载体与步骤一得到的两个退火产物分别进行连接，得连接产物；

五、将步骤四的连接产物转入感受态细胞内，培养后，挑取单菌落进行PCR验证，对PCR验证为阳性的单菌落，提取重组质粒DNA，对重组质粒DNA采用BbsI酶进行单酶切验证，对验证为阳性的重组质粒DNA，命名为pX330-puro TK或pX330-puro DP重组载体。

2.根据权利要求1所述的基于CRISPR/Cas9系统靶向敲除KHV基因的敲除载体构建方法，其特征在于步骤三中单酶切反应体系如下：

酶切反应条件：37℃反应3h。

3.根据权利要求1所述的基于CRISPR/Cas9系统靶向敲除KHV基因的敲除载体构建方法，其特征在于步骤三中去磷反应条件：线性化的pX330-puro载体30μL，SAP 1μL，Buffer 5μL，ddH₂O 14μL，反应30min后，60℃终止SAP作用15min。

4.根据权利要求1所述的基于CRISPR/Cas9系统靶向敲除KHV基因的敲除载体构建方法，其特征在于步骤四中连接体系如下：

连接反应条件：17℃反应12h。

5.基于CRISPR/Cas9系统靶向敲除KHV基因的crRNA原件，其特征在于crRNA原件为crRNA-TK和crRNA-DP，所述crRNA-TK为双链DNA，其正义链如序列表中的SEQ ID NO：1所示，反义链如序列表中的SEQ ID NO：2所示；所述crRNA-DP为双链DNA，其正义链如序列表中的SEQ ID NO：3所示，反义链如序列表中的SEQ ID NO：4所示。