[发明专利]基于CRISPR/Cas9系统靶向敲除KHV基因的敲除载体构建方法及其crRNA原件

说明书

技术领域

本发明涉及一种敲除载体构建方法及其crRNA原件。

背景技术

鲤鱼疱疹病(Kai herpesvirus disease,KHVD)是由是鲤鱼疱诊病毒(KHV或CyHV-3)感染引起的鲤鱼及锦鲤的一种急性传染疾病，该病的爆发给我国鱼类养殖业造成了严重的经济损失。该病毒为囊膜包被病毒，直径为170-230nm，含有20面体对称核衣壳，属于疱疹科病毒，其遗传物质属于双链DNA。目前针对疫情爆发的补救手段主要仍采用隔离与大量扑杀，尚无有效救治手段。研究证实，实验条件下鲤鱼脑细胞系CCB和鳍条细胞系KF-1是KHV的敏感细胞。

CRISPR：成簇的、规律间隔的短回文重复序列，是原核生物抵抗外来基因片段—噬菌体、质粒等的免疫防御系统。属于III型CRISPR的CRISPR/Cas9系统由三个必要的部分组成：包括crRNA、tracrRNA及Cas9核酸内切酶。目前常见的px330载体中，是将crRNA与tracrRNA进行连接组成含茎环结构的sgRNA。crRNA的5’端含20bp的特异序列，可以识别特定DNA的互补序列。在发挥识别作用过程中，与靶基因前间区3’邻近的3个(NGG)碱基称为PAM序列。在细胞内转染px-330后，含有crRNA的gRNA将Cas9核酸酶带到基因组上的具体靶点，从而对特定基因位点进行切割导致突变，从而实现基因敲除。pX330-U6-Chimenic_BB-CBh-hSpCas9(pX330-puro）转基因供体质粒关键原件示意图如图2所示，关键元件含有组成gRNA的crRNA片段和tracerRNA片段，Cas9蛋白及Puro抗性基因完整表达盒。

目前，CRISPR系统作为高效DNA编辑工具已被大量应用，有报道称该系统可以在细胞水平通过在病毒基因组DNA中造成特异性的双链断裂从而阻抑相应病毒在胞内的复制如属于cccDNA病毒的HBV和感染过程中存在pre-DNA形式的EBV、HIV，不过尚未有采用该策略成功抑制鱼类DNA病毒的报道。

发明内容

本发明是要解决现有方法抑制KHVD不足的问题，提供一种基于CRISPR/Cas9系统靶向敲除KHV基因的敲除载体构建方法及其crRNA原件。

本发明基于CRISPR/Cas9系统靶向敲除KHV基因的敲除载体构建方法，按以下步骤进行：

一、依据KHV基因组TK(GenBank:AB375385.1)和DP(GenBank:AY939862.1)基因设计crRNAs，通过http://crispr.mit.edu/设计优化并分别合成crRNA-TK引物和crRNA-DP引物，于沸水处理15min，而后自然降温过夜退火，分别得到两个带有BbsI酶切粘性末端的DNA双链退火产物；

二、为了便于筛选克隆化细胞系，本发明前期工作对能够携带CRISPR/Cas9的pX330载体(pX330-U6-Chimenic_BB-CBh-hSpCas9；http://www.addgene.org/42230)进行了改造，成功制备了含有puromycin抗性基因的pX330-puro载体，如图1所示；

三、对pX330-puro载体采用BbsI进行单酶切，而后采用SAP磷酸酶进行去磷反应，回收线性化的pX330-puro载体；

四、采用T4连接酶，对步骤三回收得到的线性化的pX330-puro载体与步骤一得到的两个退火产物分别进行连接，得连接产物；

五、将步骤四的连接产物转入感受态细胞内，培养后，挑取单菌落进行PCR验证，对PCR验证为阳性的单菌落，提取重组质粒DNA，对重组质粒DNA采用BbsI酶进行单酶切验证，对验证为阳性的重组质粒DNA，命名为pX330-puro TK或pX330-puro DP重组载体。

其中步骤一中crRNA-TK引物序列为： 

上游引物：5’-CACCGTGCTCTTGCCCGCGAACAT-3’

下游引物：5’-AAACATGTTCGCGGGCAAGAGCAC-3’

crRNA-DP引物序列为： 

上游引物：5’-CACCGCCGTGTTCCTCACGTACTCG-3’

下游引物：5’-AAACCGAGTACGTGAGGAACACGGC-3’