[发明专利]一种克氏原螯虾SSR引物的制备方法

摘要

本发明公开了一种克氏原螯虾SSR引物的制备方法，包括一、提取克氏原螯虾基因组DNA从克氏原螯虾腹部肌肉提取基因组DNA；二、探针与目的片段杂交将生物素标记的探针与目的片段杂交获得杂交产物；三、磁珠富集将杂交产物用磁珠富集法富集得富集产物；四、阳性克隆测序并根据微卫星侧翼序列设计引物扩增基因DNA；五、SSR引物检测五大步骤。本发明能够简单、快速地筛选克氏原螯虾整个基因组中的微卫星序列，在短时间内能开发大量的SSR引物，为克氏原螯虾的种质保护、遗传改良提供技术手段。

主权项

一种克氏原螯虾SSR引物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：一、提取克氏原螯虾基因组DNA：从克氏原螯虾腹部肌肉提取基因组DNA；二、探针与目的片段杂交：将生物素标记的探针与目的片段杂交获得杂交产物；三、磁珠富集：将杂交产物用磁珠富集法富集得富集产物；四、阳性克隆测序并根据微卫星侧翼序列设计引物扩增基因DNA：富集产物经扩展后，转化感受态细胞，培养后蓝白斑法挑选阳性克隆，PCR检验阳性克隆，测序，用Chromas V2.33软件分析测序结果,去掉载体序列和接头序列；用SSR Hunter软件对插入序列进行分析，找出其中的微卫星DNA区域；根据微卫星区域的特征，对测序结果进行分型；用Primer Premier 5.0软件为微卫星序列设计PCR扩增引物，引物设计的参数要求为：引物长度为18‑22bp；产物长度不小于80bp，不长于500bp；扩增退火温度在50‑63℃之间，正反引物间Tm值相差不超过3℃；GC含量在40‑60%之间；五、SSR引物检测：对每个位点引物的有效性和多态性进行筛选，得到有效的微卫星位点，挑选3个DNA模板对所有合成的引物进行PCR 扩增，退火温度使用设计引物时的50‑62℃，微卫星PCR 扩增反应体系为25μL，扩增条件为：PCR反应为25个循环，每个循环包括：95℃变性30s，54℃退火1min，72℃延伸1min，首次循环前预变性5min，最后一次循环结束后，72℃再延伸10min；扩增产物按照5:1的体积比加入上样缓冲液， 95℃变性5min，立即‑20℃冻存15min，在8%的聚丙烯酰胺凝胶上电泳，100W恒功率电泳2h，用银染法进行染色、显色、定影，凝胶成像仪记录凝胶图像；将正常扩增的引物对用挑选出的DNA模板在退火温度50‑62℃下进行PCR扩增，在聚丙烯酰胺胶上电泳的结果读带，选择带型清晰，至少有两个或两个以上等位基因的引物；所得克氏原螯虾SSR引物为由正向引物和反向引物组成的引物对，所述引物对选自以下之一：F: 5’‑CCTCGGGTGTGGTGTTAGTG‑3’和R: 5’‑TCAGGAGACAGGTTTGGTGTG‑3’、 F: 5’‑ CCTCGGGTGTGGTGTTAGTG ‑3’和R: 5’‑ TCAGGAGACAGGTTTGGTGTG ‑3’、 F: 5’‑ CCTCGGGTGTGGTGTTAGTG ‑3’和R: 5’‑ TCAGGAGACAGGTTTGGTGTG ‑3’、 F: 5’‑ AGCCCGATAGCCTCAGGAAT ‑3’和R: 5’‑ ATGAGCTTCAGCGGACAGG ‑3’、F: 5’‑ CCACCAACATCGGTCTACCC ‑3’和R: 5’‑ CGCTCCATGCAATGATGCTG ‑3’；探针与目的片段的杂交具体包括以下步骤：(1)克氏原螯虾基因组DNA片段的获得：使用MseI酶切克氏原螯虾基因组DNA，37℃孵育3h；(2) 酶切产物的回收：使用胶回收试剂盒回收酶切后产物中的400‑1200bp片段得回收后DNA片段；(3)接头的制作：将MseI接头A和MseI接头B两条核苷酸链分别加ddH2O溶解至50 μmol/L；等比例混合两组寡核苷酸链，95℃变性10 min，然后自然冷却至室温得MseI接头，‑20 ℃保存待用；(4) 回收后DNA片段与接头的连接：将回收后DNA片段与MseI接头连接得连接产物；(5) 连接产物的预扩增：以连接产物为模板， MseI‑N为引物进行预扩增，PCR反应设置为：72℃反应7min以补齐接头，94℃预变性4min, ，94℃变性1min, 53℃退火1min, 72℃延伸1min，反应30个循环，最后72℃延伸7min，预扩增产物4℃保存待用；(6) 生物素探针杂交：取预扩增产物18μL，100℃水浴解链10min，加入55℃预热的杂交缓冲液77μL和生物素标记的探针5μL，构成100μL杂交体系，55℃水浴30min后冷却至室温，加入300μL TEN100缓冲液混匀获得杂交产物，4℃保存备用；探针序列为5’‑ ACACACACACACACAC ‑3’ ；所述MseI接头A的序列为：5’‑TACTCAGGACTCAT‑3’；MseI接头B的序列为：5’‑GACGATGAGTCCTGAG‑3’；所述MseI‑N的序列为：5’‑GATGAGTCCTGAGTAA(N)‑3’。