[发明专利]一种克氏原螯虾SSR引物的制备方法

权利要求书

1.一种克氏原螯虾SSR引物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

一、提取克氏原螯虾基因组DNA：从克氏原螯虾腹部肌肉提取基因组DNA；

二、探针与目的片段杂交：将生物素标记的探针与目的片段杂交获得杂交产物；

三、磁珠富集：将杂交产物用磁珠富集法富集得富集产物；

四、阳性克隆测序并根据微卫星侧翼序列设计引物扩增基因DNA：富集产物经扩展后，转化感受态细胞，培养后蓝白斑法挑选阳性克隆，PCR检验阳性克隆，测序，

用Chromas V2.33软件分析测序结果,去掉载体序列和接头序列；用SSR　Hunter软件对插入序列进行分析，找出其中的微卫星DNA区域；根据微卫星区域的特征，对测序结果进行分型；用Primer Premier 5.0软件为微卫星序列设计PCR扩增引物，引物设计的参数要求为：引物长度为18-22bp；产物长度不小于80bp，不长于500bp；扩增退火温度在50-63℃之间，正反引物间Tm值相差不超过3℃；GC含量在40-60%之间；

五、SSR引物检测：对每个位点引物的有效性和多态性进行筛选，得到有效的微卫星位点，挑选3个DNA模板对所有合成的引物进行PCR 扩增，退火温度使用设计引物时的50-62℃，微卫星PCR 扩增反应体系为25μL，扩增条件为：PCR反应为25个循环，每个循环包括：95℃变性30s，54℃退火1min，72℃延伸1min，首次循环前预变性5min，最后一次循环结束后，72℃再延伸10min；扩增产物按照5:1的体积比加入上样缓冲液， 95℃变性5min，立即-20℃冻存15min，在8%的聚丙烯酰胺凝胶上电泳，100W恒功率电泳2h，用银染法进行染色、显色、定影，凝胶成像仪记录凝胶图像；将正常扩增的引物对用挑选出的DNA模板在退火温度50-62℃下进行PCR扩增，在聚丙烯酰胺胶上电泳的结果读带，选择带型清晰，至少有两个或两个以上等位基因的引物。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：

探针与目的片段的杂交具体包括以下步骤：

(1)克氏原螯虾基因组DNA片段的获得：使用MseI酶切克氏原螯虾基因组DNA，37℃孵育3h；

(2) 酶切产物的回收：使用胶回收试剂盒回收酶切后产物中的400-1200bp片段得回收后DNA片段；

(3)接头的制作：将MseI接头A和MseI接头B两条核苷酸链分别加ddH₂O溶解至50 μmol/L；等比例混合两组寡核苷酸链，95℃变性10 min，然后自然冷却至室温得MseI接头，-20 ℃保存待用；

(4) 回收后DNA片段与接头的连接：将回收后DNA片段与MseI接头连接得连接产物；

(5) 连接产物的预扩增：以连接产物为模板， MseI-N为引物进行预扩增，PCR反应设置为：72℃反应7min以补齐接头，94℃预变性4min, ，94℃变性1min, 53℃退火1min, 72℃延伸1min，反应30个循环，最后72℃延伸7min，预扩增产物4℃保存待用；

(6) 生物素探针杂交：取预扩增产物18μL，100℃水浴解链10min，加入55℃预热的杂交缓冲液77μL和生物素标记的探针5μL，构成100μL杂交体系，55℃水浴30min后冷却至室温，加入300μL TEN₁₀₀缓冲液混匀获得杂交产物，4℃保存备用。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：所述MseI接头A的序列为：5’-TACTCAGGACTCAT-3’；MseI接头B的序列为：5’-GACGATGAGTCCTGAG-3’。

4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：所述MseI-N的序列为：5’-GATGAGTCCTGAGTAA(N)-3’。

5.一种克氏原螯虾SSR引物，其特征在于：所述克氏原螯虾SSR引物为由正向引物和反向引物组成的引物对，所述引物对选自以下之一：

F: 5’-CCTCGGGTGTGGTGTTAGTG-3’和R: 5’-TCAGGAGACAGGTTTGGTGTG-3’、 F: 5’- CCTCGGGTGTGGTGTTAGTG -3’和R: 5’- TCAGGAGACAGGTTTGGTGTG -3’、 F: 5’- CCTCGGGTGTGGTGTTAGTG -3’和R: 5’- TCAGGAGACAGGTTTGGTGTG -3’、 F: 5’- AGCCCGATAGCCTCAGGAAT -3’和R: 5’- ATGAGCTTCAGCGGACAGG -3’、 F: 5’- CCACCAACATCGGTCTACCC -3’和R: 5’- CGCTCCATGCAATGATGCTG -3’。