[发明专利]一种克氏原螯虾SSR引物的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，特别涉及一种克氏原螯虾SSR引物的制备方法。

背景技术

克氏原螯虾(Procambarus clarkii)隶属于节肢动物门(Arthropoda)，甲壳纲(Crustacea)，十足目(Orgerdecapoda)，爬行亚目(Reptantia)，螯虾科(Cambaridae)，原螯虾属(Procambarus)。克氏原螯虾原产于墨西哥东北部和美国中南部，由于人类和环境因素的影响，扩散至美国至少15个州；1918 年作为牛蛙饵料引入日本，并在日本大面积繁衍和扩散；1929年由日本传入我国，目前在我国 21个省、市、自治区均有分布，并在一些湖泊和沟渠成为优势种群。目前，克氏原螯虾的遗传多样性多集中在用RAPD、线粒体细胞色素I(COI)和微卫星等分子技术进行研究，其结果仍存在部分需要完善之处，因此，高效、全面、稳定的SSR技术的应用对克氏原螯虾遗传多样性的揭示具有很好的补充意义，以期为克氏原螯虾遗传育种、种质资源保护及可持续利用提供一定的理论依据。

微卫星标记，亦称简单重复序列(simple sequence repeats，SSR)，微卫星DNA分子标记在各种生物体内广泛分布,它具有数量大、多态信息含量高、特异性强、重复性好、检测快速方便等特点,目前被广泛应用于对动、植物的基因定位、连锁分析、血缘关系鉴定、遗传多样性评估、系统发生树构建、标记辅助选择、群体进化研究和品质鉴定等方面探讨。克氏原螯虾的微卫星分离在国内外还未见报道。

SSR在基因组中分布广泛,密度很高,在生物基因组中发挥着不同功能。另外SSR与其它遗传标记相比较,具有位点众多，多态性程度高,检测时对DNA模板要求程度低,检测简单快速,是一个良好的遗传标记。SSR缺点是对于未知DNA序列的生物,SSR基因位点开发较繁琐,成本较高。对于绝大多数非模式生物或非经济类作物,SSR相关资料很少,因此开发这些生物的SSR位点,对于生态监控和系统发生学研究尤为重要,也可以为以后相关研究提供良好的基础。SSR 标记虽然效果好，可靠性高，但其关键点又在于SSR 引物的开发。只有在有一定数量的SSR 引物之后，才可能对某一物种进行SSR 标记的分析。特别是对于没有测序过的生物物种，对于其DNA 碱基序列知之甚少或一无所知的物种只能利用一些特殊的方法得到这种重复序列以及其两边的侧翼序列来设计SSR 引物。目前SSR 引物的来源，概括起来有以下四种途径：1. 关文献；2. 近缘种的引物( 例如同属不同种) ；3. 数据库搜寻法：在GenBank 等公共数据库中搜寻SSR序列，根据侧翼序列设计引物；4. 自己从研究对象基因组文库中筛选SSR位点两翼序列设计引物。针对那些大多数测序很少的物种第4种方法几乎是唯一途径，也是最根本、有效的方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种克氏原螯虾SSR引物的制备方法，能够简单、快速地筛选克氏原螯虾整个基因组中的微卫星序列，在短时间内能开发大量的SSR引物，为克氏原螯虾的种质保护、遗传改良提供技术手段。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

一种克氏原螯虾SSR引物的制备方法，包括以下步骤：

一、提取克氏原螯虾基因组DNA：从克氏原螯虾腹部肌肉提取基因组DNA；

二、探针与目的片段杂交：将生物素标记的探针与目的片段杂交获得杂交产物；

三、磁珠富集：将杂交产物用磁珠富集法富集得富集产物；

四、阳性克隆测序并根据微卫星侧翼序列设计引物扩增基因DNA：富集产物经扩展后，转化感受态细胞，培养后蓝白斑法挑选阳性克隆，PCR检验阳性克隆，测序，

用Chromas V2.33软件分析测序结果,去掉载体序列和接头序列；用SSR　Hunter软件对插入序列进行分析，找出其中的微卫星DNA区域；根据微卫星区域的特征，对测序结果进行分型；用Primer Premier 5.0软件为微卫星序列设计PCR扩增引物，引物设计的参数要求为：引物长度为18-22bp；产物长度不小于80bp，不长于500bp；扩增退火温度在50-63℃之间，正反引物间Tm值相差不超过3℃；GC含量在40-60%之间；