[发明专利]一种尘螨特异性IgG4亚型抗体校准品及其制备方法

摘要

本发明公开了一种尘螨特异性IgG4亚型抗体校准品及其制备方法，通过采集临床过敏病人进行脱敏治疗之后的血清作为候选血清，并采用法玛西亚UniCap检测系统对所得候选血清进行尘螨特异性IgG4亚型抗体检测筛选，然后对筛选得到的候选血清进行提取、纯化并采用冻存液替换稀释血清基质来制备所述尘螨特异性IgG4亚型抗体校准品；然后结合真空冷冻干燥方法制备冻干尘螨特异性IgG4亚型抗体校准品来保证所得校准品的均一性和稳定性。涉及的制备方法科学、严谨、完善，并经过协作标定、数据统计，保证效价定值准确，制得的尘螨特异性IgG4亚型抗体校准品可用于标定尘螨特异性IgG4亚型抗体的含量，从而判断脱敏治疗疗效。

主权项

一种尘螨特异性IgG4亚型抗体校准品，其特征在于，所述校准品中尘螨特异性IgG4亚型抗体蛋白浓度为1ug/mL，纯度≥95wt％；所述尘螨特异性IgG4亚型抗体校准品由以下方法制备而成：(1)候选血清的制备：对临床适应症为过敏的病人进行脱敏治疗之后，无菌采取血液并收集到无菌的采血管中，在室温条件下静置，待血清析出后，取上清，离心分离血清，作为候选血清；(2)候选物的筛选：通过法玛西亚UniCap检测系统对候选血清进行尘螨特异性IgG4亚型抗体检测，选择尘螨特异性IgG4亚型抗体≥0.1mg/mL的高阳血清作为候选物；(3)尘螨特异性IgG4亚型抗体的提取与纯化：1)尘螨亲和层析纯化，将筛选出的候选物经过尘螨亲和层析柱上样，洗杂，洗脱，收集洗脱后的蛋白吸收峰组分；2)抗人IgG4亚型抗体亲和层析纯化，将步骤1)洗脱所得的蛋白吸收峰组分经抗人IgG4亚型抗体亲和层析柱上样，洗杂，洗脱，收集得第二次蛋白吸收峰组分；3)分子筛层析纯化，将步骤2)洗脱后的第二次蛋白吸收峰组分经分子筛层析柱上样，洗脱，收集得第三次蛋白吸收峰组分；4)浓缩、除菌、蛋白浓度测定、蛋白纯度鉴定，将洗脱后所得的第三次蛋白吸收峰组分经离心超滤浓缩，然后通过微孔滤膜除菌，得尘螨特异性IgG4亚型抗体提纯物，然后采用凯氏定氮法检测其蛋白浓度；采用SDS‑PAGE方法测定其蛋白纯度；(4)校准品的分装、冻干、熔封：1)配制冻存液，在磷酸根摩尔浓度为0.01mol/L，Tween20体积分数为1‰，pH＝7.2～7.4的PBST缓冲液中加入酪蛋白和核糖，使酪蛋白的质量分数为0.5～5％，核糖的质量分数为1～10％，得冻存液；将所得冻存液用微孔滤膜进行抽滤，得抽滤冻存液；2)将所得尘螨特异性IgG4亚型抗体提纯物用制得的抽滤冻存液稀释至蛋白浓度为1μg/mL，得所述尘螨特异性IgG4亚型抗体校准品；3)将所得尘螨特异性IgG4亚型抗体校准品进行无菌分装，并用铝箔纸封口后在‑80℃温度下过夜；4)过夜后在铝箔纸上扎小孔，进行真空冷冻干燥、熔封，得冻干尘螨特异性IgG4亚型抗体校准品；(5)冻干尘螨特异性IgG4亚型抗体校准品的鉴定：1)物理性状检验；2)无菌检验、真空度检验，按照《中国药典》的规定方法进行检验；3)剩余水分测定，按照《中国药典》的规定，以真空烘干法进行剩余水分测定，应不超过标准规定的4％；4)均一性检验，随机抽取规定数量的样品，使用免疫球蛋白G4测定试剂盒，注册号为国食药监械(进)字2014第2400357号，进行标定，实验结果应一致；5)稳定性试验，采用热加速稳定性试验方法，检查在高温条件下样品放置的时间，并以此数据作为依据，为下一批稳定性试验作基础；6)定值，选择3个以上对血清学试验有经验的实验室或医院检验科，每个实验室使用3个样品，每个样品重复2次，各协作标定单位按照协作标定方案的要求，使用免疫球蛋白G4测定试剂盒，注册号为国食药监械(进)字2014第2400357号，进行标定，并将标定结果交给组织单位。