[发明专利]一种尘螨特异性IgG4亚型抗体校准品及其制备方法

权利要求书

1.一种尘螨特异性IgG4亚型抗体校准品，其特征在于，所述校准品中尘螨特异性IgG4亚型抗体蛋白浓度为1ug/mL，纯度≥95wt％。

2.权利要求1所述尘螨特异性IgG4亚型抗体校准品的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)候选血清的制备：对临床适应症为过敏的病人进行脱敏治疗之后，无菌采取血液并收集到无菌的采血管中，在室温条件下静置，待血清析出后，取上清，离心分离血清，作为候选血清；

(2)候选物的筛选：通过法玛西亚UniCap检测系统对候选物进行尘螨特异性IgG4亚型抗体检测，选择尘螨特异性IgG4亚型抗体≥0.1mg/mL的高阳血清作为候选物；

(3)尘螨特异性IgG4亚型抗体的提取与纯化：

1)尘螨亲和层析纯化，将筛选出的候选物经过尘螨亲和层析柱上样，洗杂，洗脱，收集洗脱后的蛋白吸收峰组分；

2)抗人IgG4亚型抗体亲和层析纯化，将步骤1)洗脱所得的蛋白吸收峰组分经抗人IgG4亚型抗体亲和层析柱上样，洗杂，洗脱，收集得第二次蛋白吸收峰组分；

3)分子筛层析纯化，将洗脱后的蛋白吸收峰经分子筛层析柱上样，洗脱，收集得第三次蛋白吸收峰组分；

4)浓缩、除菌、蛋白浓度测定、蛋白纯度鉴定，将洗脱后所得的三次蛋白吸收峰组分经离心超滤浓缩，然后通过微孔滤膜除菌，得尘螨特异性IgG4亚型抗体提纯物，然后采用凯氏定氮法检测其蛋白浓度；采用SDS-PAGE方法测定其蛋白纯度；

(4)校准品的分装、冻干、熔封：

1)配制冻存液，在磷酸根摩尔浓度为0.01mol/L，Tween20体积分数为1‰，pH＝7.2～7.4的PBST缓冲液中加入酪蛋白和核糖，使酪蛋白的质量分数为0.5～5％，核糖的质量分数为1～10％，得冻存液；将所得冻存液用微孔滤膜进行抽滤，得抽滤冻存液；

2)将所得尘螨特异性IgG4亚型抗体提纯物用制得的抽滤冻存液稀释至蛋白浓度为1μg/mL，得所述尘螨特异性IgG4亚型抗体校准品；

3)将所得尘螨特异性IgG4亚型抗体校准品进行无菌分装，并用铝箔纸封口后在-80℃温度下过夜；

4)过夜后在铝箔纸上扎小孔，进行真空冷冻干燥、熔封，得所述冻干尘螨特异性IgG4亚型抗体校准品；

(5)冻干尘螨特异性IgG4亚型抗体校准品的鉴定：

1)物理性状检验；

2)无菌检验、真空度检验，按照《中国药典》的规定方法进行检验；

3)剩余水分测定，按照《中国药典》的规定，以真空烘干法进行剩余水分测定，应不超过标准规定的4％；

4)均一性检验，随机抽取规定数量的样品，使用免疫球蛋白G4测定试剂盒(散射比浊法)，注册号为国食药监械(进)字2014第2400357号，进行标定，实验结果应一致；

5)稳定性试验，采用热加速稳定性试验方法，检查在高温条件下样品放置的时间，并以此数据作为依据，为下一批稳定性试验作基础；

6)定值(协作标定)，选择3个以上具有对血清学试验有经验的实验室或医院检验科，每个实验室使用3个样品，每个样品重复2次，各协作标定单位按照协作标定方案的要求，使用免疫球蛋白G4测定试剂盒(散射比浊法)，注册号为国食药监械(进)字2014第2400357号，进行标定，并将标定结果交给组织单位。

3.根据权利要求2所述的尘螨特异性IgG4亚型抗体校准品的制备方法，其特征在于，所述尘螨亲和层析柱所用凝胶为经尘螨致敏蛋白偶联的CNBR-activated Sepharose 4B溶胀基质。

4.根据权利要求3所述的尘螨特异性IgG4亚型抗体校准品的制备方法，其特征在于，所述尘螨亲和层析纯化步骤为：将筛选出的候选物经尘螨亲和层析柱内上样，上样量为经尘螨致敏蛋白偶联的CNBR-activated Sepharose 4B溶胀基质体积的8倍；在洗脱前，用10倍柱体积PBS缓冲液洗柱，使A280值恢复到基线或本底水平；然后进行洗脱，用5～10倍体积的0.05M，PH为4.0的醋酸钠-醋酸缓冲液洗脱结合的蛋白；汇集A280≥0.2的峰组分，得蛋白吸收峰组分。

5.根据权利要求2所述的尘螨特异性IgG4亚型抗体校准品的制备方法，其特征在于，所述抗人IgG4亚型抗体亲和层析柱所用凝胶为经抗人IgG4抗体偶联的CNBR-activated Sepharose 4B溶胀基质。