[发明专利]一种尘螨特异性IgG4亚型抗体校准品及其制备方法

说明书

技术领域

本发明属于生物体外诊断技术领域，具体涉及一种尘螨特异性IgG4亚型抗体校准品及其制备方法。

背景技术

研究发现，在进行尘螨脱敏治疗后，患者血清中尘螨特异性IgG4亚型抗体水平显著上升(P<0.0001)。诱导产生的尘螨特异性IgG4亚型抗体水平的升高，在特异性免疫治疗过程中发挥了重要的作用，可通过检测特异性IgG4抗体水平对脱敏治疗效果进行评价。目前，体外诊断是脱敏疗效检测的常用方法。在生物制品的标准化、质量控制和效力评价中校准品是体外诊断试剂评价的标尺，起着非常重要的作用。

然而目前国际、国内均没有尘螨特异性IgG4亚型抗体的校准品，这给实际研究工作和临床检验工作带来很多不便。

发明内容

本发明的目的在于提供一种尘螨特异性IgG4亚型抗体校准品(校准物质)，用于标定尘螨特异性IgG4亚型抗体的含量，从而判断脱敏治疗疗效。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：一种尘螨特异性IgG4亚型抗体校准品，所述校准品中尘螨特异性IgG4亚型抗体蛋白浓度为1ug/mL，尘螨特异性IgG4亚型抗体蛋白纯度≥95wt％，其制备方法包括以下步骤：

(1)候选血清的制备：对临床适应症为过敏的病人进行脱敏治疗之后，无菌采取血液并收集到无菌的采血管中，在室温条件下静置，待血清析出后，取上清，离心分离血清，作为候选血清；

(2)候选物的筛选：通过法玛西亚UniCap检测系统对候选物进行尘螨特异性IgG4抗体检测，尘螨特异性IgG4亚型抗体高阳血清(≥0.1mg/mL)作为候选物；

(3)尘螨特异性IgG4亚型抗体的提取与纯化：

1)尘螨亲和层析纯化，将筛选出的候选物经过尘螨亲和层析柱上样，洗杂，洗脱，收集洗脱后的蛋白吸收峰组分；

2)抗人IgG4亚型抗体亲和层析柱纯化，将步骤1)洗脱后所得的蛋白吸收峰经抗人IgG4亚型抗体亲和层析柱上样，洗杂，洗脱，收集得第二次蛋白吸收峰组分；

3)分子筛层析纯化，将洗脱后的蛋白吸收峰经分子筛层析柱上样，洗脱，收集得第三次蛋白吸收峰组分；

4)浓缩、除菌、蛋白浓度测定、蛋白纯度鉴定，将洗脱后所得的三次蛋白吸收峰组分经离心超滤浓缩后，通过直径为0.22μm的微孔滤膜除菌后，得尘螨特异性IgG4亚型抗体提纯物，并采用凯氏定氮法检测蛋白浓度、通过SDS-PAGE测定蛋白纯度；

(4)校准品的分装、冻干、熔封：

1)配制冻存液，在磷酸根摩尔浓度为0.01mol/L，Tween20体积分数为1‰，pH＝7.2～7.4的PBST缓冲液中加入酪蛋白和核糖，使酪蛋白的质量分数为0.5～5％，核糖的质量分数为1～10％，得冻存液；将所得冻存液用微孔滤膜进行抽滤，得抽滤冻存液；

2)将所得尘螨特异性IgG4亚型抗体提纯物用制得的抽滤冻存液稀释至1μg/mL，得所述尘螨特异性IgG4亚型抗体校准品；

3)将所得标准浓度蛋白溶液进行无菌分装，并用铝箔纸封口后在-80℃温度下过夜；

4)过夜后在铝箔纸上扎小孔，进行真空冷冻干燥、熔封，得所述冻干尘螨特异性IgG4亚型抗体校准品。

(5)冻干尘螨特异性IgG4亚型抗体校准品的鉴定：

1)物理性状检验；

2)无菌检验、真空度检验，按照《中国药典》的规定方法进行检验；

3)剩余水分测定，按照《中国药典》的规定，以真空烘干法进行剩余水分测定，应不超过标准规定的4％；

4)均一性检验，随机抽取规定数量的样品，使用免疫球蛋白G4测定试剂盒(散射比浊法)，注册号为国食药监械(进)字2014第2400357号，进行标定，实验结果应一致。

5)稳定性试验，采用热加速稳定性试验方法，检查在高温条件下样品放置的时间，并以此数据作为依据，为下一批稳定性试验作基础。

6)定值(协作标定)，选择3个以上具有对血清学试验有经验的实验室或医院检验科，每个实验室使用3个样品，每个样品重复2次，各协作标定单位按照协作标定方案的要求，使用免疫球蛋白G4测定试剂盒(散射比浊法)，注册号为国食药监械(进)字2014第2400357号，进行标定，并将实验结果交给组织单位。

根据上述方案，所述尘螨亲和层析柱所用胶凝为经尘螨致敏蛋白偶联的CNBR-activated Sepharose 4B溶胀基质。