[发明专利]一种重组阿魏酸酯酶的制备方法

摘要

本发明公开了一种重组阿魏酸酯酶的制备方法，利用阿魏酸酯酶O42807，密码子优化后人工合成其基因fae、构建pAO815-fae表达载体、构建pPIC9K-fae表达载体以及将pPIC9K-fae表达载体转化至毕赤酵母GS115中表达，得到重组阿魏酸酯酶，SDS-PAGE分析显示其发酵上清液为单一条带，表观分子量为42kDa，酶活为4.7U/mL，比酶活力为31.4U/mg，最适反应温度为50℃，最适pH为5.0～5.5。本发明获得了1株高效表达的重组阿魏酸酯酶转化子，与阿魏酸酯酶O42807相比其表达效率和表达量大大提高。

主权项

一种重组阿魏酸酯酶的制备方法，其特征在于：包括：1)获得目的基因fae：根据阿魏酸酯酶的氨基酸序列，以毕赤酵母标准密码子优化设计阿魏酸酯酶的基因序列，并在基因序列的两端分别引入Hind Ⅲ和EcoR Ⅰ酶切位点，化学合成如SEQ ID NO.1所示的基因序列，命名为fae；2)构建pAO815‑fae表达载体：用Hind Ⅲ和EcoR Ⅰ双酶切合成的基因序列fae，连接到经同样双酶切的pAO815上并转化至E.coli DH5 α感受态细胞，得到重组质粒命名为pAO815‑fae；3)构建pPIC9K‑fae表达载体：以重组质粒pAO815‑fae为模板进行PCR扩增，PCR产物用SnaB Ⅰ和Not Ⅰ双酶切，连接到经同样双酶切的pPIC9K上并转化至E.coli DH5 α感受态细胞，得到重组质粒命名为pPIC9K‑fae；4)fae在毕赤酵母中表达：用Bgl Ⅱ线性化pPIC9K‑fae，电转化毕赤酵母GS115，涂布于MD平板，筛选MD平板上生长良好的菌落点种至含G418的YPD摇瓶中，筛选抗G418的重组子，命名为GS115/pPIC9K‑fae；根据毕赤酵母操作表达手册进行GS115/pPIC9K‑fae的诱导表达，得到重组阿魏酸酯酶。