[发明专利]一种重组阿魏酸酯酶的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种重组阿魏酸酯酶的制备方法。

背景技术

植物细胞壁中，酚酸类物质(如阿魏酸、咖啡酸、对香豆酸等)通过酯键与多糖(如阿拉伯木聚糖、果糖)的阿拉伯糖基或半乳糖基相连，或者通过醚键与木质素相连，形成致密的网状结构。阿魏酸酯酶(EC 3.1.1.73,Ferul ic acid esterases,FAE)又名肉桂酸酯酶，它能水解阿魏酸酯、低聚糖阿魏酸酯和多糖阿魏酸酯中的酯键，释放出阿魏酸等功能性物质。阿魏酸酯酶可以辅助木聚糖酶、木质素酶破坏这种致密的网状结构，使细胞壁结构变得疏松，从而促进木质纤维素完全降解。在工业和农业中阿魏酸酯酶均有重要作用。

至今已经从细菌和真菌中分离得到40多种阿魏酸酯酶，但目前报道的阿魏酸酯酶的酶活及表达量都达不到工业需要。其次，阿魏酸酯酶的分离提取过程相对复杂，难以满足工业化生产。随着分子生物学的发展，已经有多个阿魏酸酯酶编码基因被克隆，利用现代生物学技术来改良微生物，使获得高产阿魏酸酯酶菌株成为可能。毕赤酵母表达系统比大肠杆菌体系有更完备的基因表达调控机制及对表达产物的加工修饰能力，并具有原核细胞系统生长速度快、便于基因操作和可工业化大规模培养等优点。毕赤酵母可高密度的发酵培养，其菌体量可达130g/L干细胞重，其在生产单细胞蛋白动物饲料方面发挥重要作用。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，提供了一种重组阿魏酸酯酶的制备方法，构建了分泌型重组质粒pPIC9K-fae，获得了1株高效表达的重组阿魏酸酯酶转化子，与阿魏酸酯酶O42807相比其表达效率和表达量大大提高。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案之一是：

一种重组阿魏酸酯酶的制备方法，包括：

1)获得目的基因fae：根据阿魏酸酯酶的氨基酸序列，以毕赤酵母标准密码子优化设计阿魏酸酯酶的基因序列，并在基因序列的两端分别引入HindⅢ和EcoRⅠ酶切位点，化学合成如SEQ ID NO.1所示的基因序列，命名为fae；

2)构建pAO815-fae表达载体：用HindⅢ和EcoRⅠ双酶切合成的基因序列fae，连接到经同样双酶切的pAO815上并转化至E.coli DH5α感受态细胞，得到重组质粒命名为pAO815-fae；

3)构建pPIC9K-fae表达载体：以重组质粒pAO815-fae为模板进行PCR扩增，PCR产物用SnaBⅠ和NotⅠ双酶切，连接到经同样双酶切的pPIC9K上并转化至E.coli DH5α感受态细胞，得到重组质粒命名为pPIC9K-fae；

4)fae在毕赤酵母中表达：用BglⅡ线性化pPIC9K-fae，电转化毕赤酵母GS115，涂布于MD平板，筛选MD平板上生长良好的菌落点种至含G418的YPD摇瓶中，筛选抗G418的重组子，命名为GS115/pPIC9K-fae；根据毕赤酵母操作表达手册进行GS115/pPIC9K-fae的诱导表达，得到重组阿魏酸酯酶。

一实施例中：所述步骤1)中，根据阿魏酸酯酶O42807成熟肽的氨基酸序列，以毕赤酵母标准密码子优化设计阿魏酸酯酶的基因序列，并在基因序列的两端分别引入HindⅢ和EcoRⅠ酶切位点，化学合成如SEQ ID NO.1所示的基因序列，命名为fae。

一实施例中：所述步骤3)中PCR扩增条件为：

上游引物：如SEQ ID NO.3所示；

下游引物：如SEQ ID NO.4所示；

反应条件：93～95℃变性29～31s，54～56℃退火29～31s，71～73℃延伸0.9～1.1min，重复所述变性-退火-延伸共29～31个循环后，71～73℃延伸9.9～10.1min。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案之二是：

一种重组阿魏酸酯酶，所述重组阿魏酸酯酶的基因序列如SEQ ID NO.1所示。

本技术方案与背景技术相比，它具有如下优点：

本发明的一种重组阿魏酸酯酶的制备方法成功构建了分泌型重组质粒pPIC9K-fae，获得了1株高效表达的重组阿魏酸酯酶转化子，与阿魏酸酯酶O42807相比其表达效率和表达量大大提高；得到的重组阿魏酸酯酶SDS-PAGE分析显示其为单一条带，表观分子量为42kDa，酶活为4.7U/mL，比酶活力为31.4U/mg，最适反应温度为50℃，最适pH为5.0～5.5。

附图说明