[发明专利]一种重组阿魏酸酯酶的制备方法

权利要求书

1.一种重组阿魏酸酯酶的制备方法，其特征在于：包括：

1)获得目的基因fae：根据阿魏酸酯酶的氨基酸序列，以毕赤酵母标准密码子优化设计阿魏酸酯酶的基因序列，并在基因序列的两端分别引入Hind Ⅲ和EcoR Ⅰ酶切位点，化学合成如SEQ ID NO.1所示的基因序列，命名为fae；

2)构建pAO815-fae表达载体：用Hind Ⅲ和EcoR Ⅰ双酶切合成的基因序列fae，连接到经同样双酶切的pAO815上并转化至E.coli DH5 α感受态细胞，得到重组质粒命名为pAO815-fae；

3)构建pPIC9K-fae表达载体：以重组质粒pAO815-fae为模板进行PCR扩增，PCR产物用SnaB Ⅰ和Not Ⅰ双酶切，连接到经同样双酶切的pPIC9K上并转化至E.coli DH5 α感受态细胞，得到重组质粒命名为pPIC9K-fae；

4)fae在毕赤酵母中表达：用Bgl Ⅱ线性化pPIC9K-fae，电转化毕赤酵母GS115，涂布于MD平板，筛选MD平板上生长良好的菌落点种至含G418的YPD摇瓶中，筛选抗G418的重组子，命名为GS115/pPIC9K-fae；根据毕赤酵母操作表达手册进行GS115/pPIC9K-fae的诱导表达，得到重组阿魏酸酯酶。

2.根据权利要求1所述的一种重组阿魏酸酯酶的制备方法，其特征在于：所述步骤1)中，根据阿魏酸酯酶O42807成熟肽的氨基酸序列，以毕赤酵母标准密码子优化设计阿魏酸酯酶的基因序列，并在基因序列的两端分别引入Hind Ⅲ和EcoR Ⅰ酶切位点，化学合成如SEQ ID NO.1所示的基因序列，命名为fae。

3.根据权利要求1所述的一种重组阿魏酸酯酶的制备方法，其特征在于：所述步骤3)中PCR扩增条件为：

上游引物：如SEQ ID NO.3所示；

下游引物：如SEQ ID NO.4所示；

反应条件：93～95℃变性29～31s，54～56℃退火29～31s，71～73℃延伸0.9～1.1min，重复所述变性-退火-延伸共29～31个循环后，71～73℃延伸9.9～10.1min。

4.一种重组阿魏酸酯酶，其特征在于：所述重组阿魏酸酯酶的基因序列如SEQ ID NO.1所示。