[发明专利]应用伴刀豆凝集素材料富集糖蛋白或糖肽中聚糖的方法

摘要

本发明涉及凝集素亲和材料的应用领域，以改性的硅胶为基质，以伴刀豆Con A为配基，制备出SG Con A材料，根据凝集素和聚糖化合物的可逆性结合作用富集糖蛋白/糖肽，将富集得到的糖蛋白/糖肽经过酶解释放聚糖，经过富集得到聚糖，结合质谱的方法鉴定聚糖的结构和构型。本发明应用亲和固定相富集聚糖化合物，可在高效液相色谱模式和固定相萃取两种模式下分别富集糖蛋白或者糖肽，并且可将此方法应用于实际样品中聚糖化合物的分离和鉴定。

主权项

1.应用伴刀豆凝集素材料富集糖蛋白或糖肽中聚糖的方法，步骤如下： a. 以经过化学改性的硅胶为基质，伴刀豆凝集素 concanavalin A (Con A)为配基，制备硅胶凝集素亲和材料 SG Con A； b. 将硅胶凝集素亲和材料SG Con A 装填为色谱柱，在高效液相色谱模式下，样品中的糖蛋白或糖肽的色谱富集条件，淋洗液和洗脱液 pH 值 5‑8，盐浓度 0.01‑1.0 M，温度 4‑60℃；所述步骤 b:其中 Con A 特异性结合甘露糖型和葡萄糖型的聚糖，不结合复杂型的聚糖，同时对高甘露糖型有特异性强结合，以不含有糖的人血清蛋白(HSA), 含有高甘露糖型的核糖胰蛋白酶 B (RNase B)和含有复合糖型的鸡卵清糖蛋白 (ovalbumin)作为色谱评价对象，评价凝集素亲和材料的富集性能；所述色谱富集条件为：1）为淋洗液为 A 相，洗脱液为 B 相，温度为 4‑60℃， 0‑10 min, 100 % A, 10‑12 min, 0‑100% B, 12‑22 min, 100 % B, 22‑25 min, 0‑100 % C, 25‑35 min, 100% C, 35‑37 min, 0‑100% A, 37‑45 min, 100% A； 淋洗液 A 相为磷酸盐(PBS)缓冲溶液，并含有 0.01M‑1M 的 NaCl，0.01‑50 mM CaCl2, 0.01‑50 mM MgCl2, 0.01‑50 mM MnCl2, pH 5‑8；洗脱液B 为含有 0.01 M‑1.0 M 竞争性糖的缓冲溶液，竞争性洗脱试剂为甲基‑α‑吡喃甘露糖或者甲基‑α‑吡喃葡萄糖，糖的浓度 0.01‑1.0 M，并含有 0.01M‑1M 的 NaCl，0.01‑50 mM CaCl2, 0.01‑50 mM MgCl2, 0.01‑50 mM MnCl2, pH 值 5‑8； 或2） 为: 取亲和材料 SG Con A 1‑2mg，装填于 Zip‑tip 小柱中，淋洗液为 A相；洗脱液为B相，取糖肽 1‑10 μg，经过A 溶液的上样、淋洗和B 溶液的洗脱, 分别收集上样液、淋洗液和洗脱液; 所述淋洗液 A 相为磷酸盐(PBS)缓冲溶液，并含有 0.01M‑1.0 M 的 NaCl，1‑10 mM CaCl2, 1‑10 mM MgCl2, 1‑10 mM MnCl2, pH 5‑8；所述洗脱液 B 相为含有 0.01 M‑1.0 M 竞争性糖的磷酸盐缓冲溶液, 竞争性糖为甲基‑α‑吡喃甘露糖或者甲基‑ α‑吡喃葡萄糖；c. 制备糖蛋白/糖肽：将所得糖蛋白或糖肽馏分经过脱盐，PNGase F 酶解、或 trypsin 酶解脱盐后再经过 PNGase F 酶解 释放出糖链，并再次脱盐，应用亲水性材料富集聚糖；步骤 c 中脱盐过程为： 1）. 用透析袋透析脱盐，透析袋截留糖蛋白的分子量 1000‑20000 Da； 或 2）. 应用反相色谱柱脱盐，流动相条件: 反相 C18 色谱柱，100‑500 Å，5‑50 μm，A 相为水含有 0.1% 甲酸(FA)，B 相为乙腈含有0.1%甲酸 (FA), 洗脱梯度为1‑10 min, 100% A, 10‑20min, 80% B 体积浓度, 接收10 min 以后的馏分，将所接馏分离心浓缩后，低温保存。