[发明专利]应用伴刀豆凝集素材料富集糖蛋白或糖肽中聚糖的方法

权利要求书

1.应用伴刀豆凝集素材料富集糖蛋白或糖肽中聚糖的方法，步骤如下：

a. 以经过化学改性的硅胶为基质，伴刀豆凝集素 concanavalin A (Con A)为配基，制备硅胶凝集素亲和材料 SG Con A；

b. 将硅胶凝集素亲和材料SG Con A 装填为色谱柱，在高效液相色谱模式下，样品中的糖蛋白或糖肽的色谱富集条件，淋洗液和洗脱液 pH 值 5-8，盐浓度 0.01-1.0 M，温度4-60℃；

所述步骤 b:其中 Con A 特异性结合甘露糖型和葡萄糖型的聚糖，不结合复杂型的聚糖，同时对高甘露糖型有特异性强结合，以不含有糖的人血清蛋白(HSA), 含有高甘露糖型的核糖胰蛋白酶 B (RNase B)和含有复合糖型的鸡卵清糖蛋白 (ovalbumin)作为色谱评价对象，评价凝集素亲和材料的富集性能；

所述色谱富集条件为：

1）为淋洗液为 A 相，洗脱液为 B 相，温度为 4-60℃， 0-10 min, 100 % A, 10-12min, 0-100% B, 12-22 min, 100 % B, 22-25 min, 0-100 % C, 25-35 min, 100% C,35-37 min, 0-100% A, 37-45 min, 100% A； 淋洗液 A 相为磷酸盐(PBS)缓冲溶液，并含有 0.01M-1M 的 NaCl，0.01-50 mM CaCl2, 0.01-50 mM MgCl₂, 0.01-50 mM MnCl₂, pH5-8；洗脱液B 为含有 0.01 M-1.0 M 竞争性糖的缓冲溶液，竞争性洗脱试剂为甲基-α-吡喃甘露糖或者甲基-α-吡喃葡萄糖，糖的浓度 0.01-1.0 M，并含有 0.01M-1M 的 NaCl，0.01-50 mM CaCl₂, 0.01-50 mM MgCl₂, 0.01-50 mM MnCl₂, pH 值 5-8；

或2） 为: 取亲和材料 SG Con A 1-2mg，装填于 Zip-tip 小柱中，淋洗液为 A相；洗脱液为B相，取糖肽 1-10 μg，经过A 溶液的上样、淋洗和B 溶液的洗脱, 分别收集上样液、淋洗液和洗脱液; 所述淋洗液 A 相为磷酸盐(PBS)缓冲溶液，并含有 0.01M-1.0 M 的NaCl，1-10 mM CaCl₂, 1-10 mM MgCl₂, 1-10 mM MnCl₂, pH 5-8；所述洗脱液 B 相为含有0.01 M-1.0 M 竞争性糖的磷酸盐缓冲溶液, 竞争性糖为甲基-α-吡喃甘露糖或者甲基-α-吡喃葡萄糖；

c. 制备糖蛋白/糖肽：将所得糖蛋白或糖肽馏分经过脱盐，PNGase F 酶解、或trypsin 酶解脱盐后再经过 PNGase F 酶解 释放出糖链，并再次脱盐，应用亲水性材料富集聚糖；步骤 c 中脱盐过程为： 1）. 用透析袋透析脱盐，透析袋截留糖蛋白的分子量1000-20000 Da； 或 2）. 应用反相色谱柱脱盐，流动相条件: 反相 C18 色谱柱，100-500Å，5-50 μm，A 相为水含有 0.1% 甲酸(FA)，B 相为乙腈含有0.1%甲酸 (FA), 洗脱梯度为1-10 min, 100% A, 10-20min, 80% B 体积浓度, 接收10 min 以后的馏分，将所接馏分离心浓缩后，低温保存。

2.按照权利要求 1 所述的方法制备 SG Con A 材料，其特征在于： 步骤 a：经过化学改性的硅胶含有一定碳链长度的间隔臂，间隔臂含有 3~12 个碳原子，其一端和硅胶相连，末端为含有 N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)的官能团。