[发明专利]一种鉴别新城疫Lasota疫苗毒株和基因Ⅶ型流行毒株复合套式聚合酶链式反应诊断试剂盒

摘要

本发明公开了一种能鉴别新城疫Lasota疫苗毒株和基因Ⅶ型流行毒株复合套式聚合酶链式反应诊断试剂盒，由反转录混合液、一扩混合液、二扩混合液、阴性对照和阳性对照组成。该试剂盒针对新城疫病毒F基因设计6条引物，经过引物浓度、聚合酶浓度、退火温度等优化，建立了鉴别诊断方法。本发明方法灵敏度高，特异性好，既能检测出目前流行的新城疫基因Ⅶ型流行毒株感染，又能判断是否是Lasota疫苗接种阳性，结果直观准确，适用于大范围新城疫疫情普查诊断，避免误诊造成的损失。

主权项

一种用于鉴别新城疫Lasota疫苗毒株和基因Ⅶ型流行毒株复合套式聚合酶链式反应诊断试剂盒，其特征在于，该试剂盒由反转录混合液、一扩混合液、二扩混合液、阴性对照和阳性对照组成；所述反转录混合液由DEPC处理灭菌水、2.5m mol·L^‑1dNTP、5×AMV Buffer 、25 μmol·L^‑1 NDV‑1F上游引物、5U/μL AMV反转录酶和40U/μL HPR I RNA酶抑制剂组成；每个反应体积比为10：4：4：1：0.5：0.5，共计20μL，50个反应共计1000μL，装成1管；所述一扩混合液由灭菌三蒸水、10×PCR Buffer、2.5m mol·L^‑1dNTP、25 μmol·L^‑1 NDV‑1F上游引物、25 μmol·L^‑1 NDV‑1R下游引物、5U/μL rTaq DNA聚合酶组成，每个反应体积比为17：2.5：2：0.5：0.5：0.5，共计23 μL，50个反应共计1150μL，装成1管；所述二扩混合液由灭菌三蒸水、10×PCR Buffer、2.5m mol·L^‑1dNTP、25 μmol·L^‑1 NDV‑2F上游引物、25 μmol·L^‑1 NDV‑2R下游引物、NDV‑3F上游引物、25 μmol·L^‑1 NDV‑3R下游引物、5U/μL rTaq DNA聚合酶组成，每个反应体积比为16：2.5：2：0.5：0.5：0.5：0.5：0.5，共计23 μL，50个反应共计1150μL，装成1管；所述阴性对照为灭菌三蒸水，每个反应对照为250μL，50个反应共计12500μL，分装成10管，每管为1250μL；所述阳性对照为Lasota疫苗株鸡胚培养尿囊液，每个反应对照为250μL，50个反应共计12500μL，分装成10管，每管为1250μL；所述的引物NDV‑1F序列为：5’‑ GCTAACTCCGTTGCCGACT ‑3’；所述的引物NDV‑1R序列为：5’‑ AAGCTTGTATAAAGCAGCTG ‑3’；所述的引物NDV‑2F序列为：5’‑ ATGGGCYCCAGACCTTCTAC ‑3’；所述的引物NDV‑2R序列为：5’‑ CTGCCACTGCTAGTTGTGAT ‑3’；所述的引物NDV‑3F序列为：5’‑ ACCTCGAGGAGGGAGCCT ‑3’；所述的引物NDV‑3R序列为：5’‑ TAGCGATATTCAGCCATAC ‑3’。