[发明专利]一种鉴别新城疫Lasota疫苗毒株和基因Ⅶ型流行毒株复合套式聚合酶链式反应诊断试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及一种鉴别新城疫Lasota疫苗毒株和基因Ⅶ型流行毒株复合套式聚合酶链式反应诊断试剂盒，属于动物医学动物疫病分子生物学诊断技术领域。

背景技术

新城疫（Newcastle disease，ND）是严重危害禽类的病毒性传染病之一，是我国法定的一类动物疫病。新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV）属副黏病毒科、腮腺炎病毒属（Rubulavirus），有囊膜，具有能刺激宿主产生抑制红细胞凝集素和病毒中和抗体的抗原成分。病毒核酸类型为单股、负链、不分节段的RNA。在NDV基因组上依次排列着NP、P、M、F、HN和L基因，分别编码核衣壳蛋白（NP）、磷蛋白（P）、基质蛋白（M）、融合蛋白（F）、血凝素-神经氨酸酶（HN）和大分子蛋白（L），其中F、HN蛋白与NDV致病性密切相关。

目前，虽然国内养禽场对新城疫的预防极为重视，但新城疫的流行仍频繁发生，损失巨大。因此，及早诊断、尽快控制新城疫对减少经济损失有重要意义。在我国国家标准《新城疫诊断技术》（GB/T16550-2008）中，诊断方法有临床诊断、病毒分离鉴定、血凝-血凝抑制试验和反转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）。其中临床诊断只能初步诊断，确诊方法中病毒分离鉴定、血凝-血凝抑制试验均需进行病毒分离，耗时较长，不适应临床快速诊断的要求。RT-PCR技术具有灵敏度高、特异性好、快速准确的优点，十分适合养殖场快速定性诊断的需要。但是，由于我国饲养的禽广泛应用新城疫活疫苗且免疫频率高，其中以Lasota株应用最为广泛，导致禽群中普遍存在Lasota疫苗毒株，用常规RT-PCR诊断方法不能确定所检测到的毒株是新城疫Lasota疫苗株还是流行毒株，为临床诊断造成极大困难。

为了解决鉴别诊断疫苗毒和流行毒这一问题，国内外学者做了大量的探索工作。1989年，Dellaporta等用V4株建立了一组特异性单抗制剂，不仅能区别NDV的自然感染和人工免疫，而且与其他副粘病毒属病毒不发生交叉反应。但是其缺点是制备难度大、成本高，且目前并无商品化应用的成熟产品。Jarecki Black等建立了RNA杂交技术进行强弱毒株区分，设计了2个探针，探针长21个碱基，与强毒株Texas的F蛋白裂解位点基因互补，可与11个速发性毒株、5个中发性毒株的RNA杂交，而不能与对照的7个弱毒株RNA杂交。但由于RNA杂交技术操作繁琐，难度大，难以在普通实验室进行，亦无商品化产品可以应用，目前仍停留在实验室研究阶段。孙军峰等根据基因Ⅶ型新城疫病毒F基因裂解位点特征设计一对引物和TapMan探针，建立的基因Ⅶ型毒株荧光定量RT-PCR鉴别检测方法，特异性良好，最低可检测到l00拷贝/微升的模板RNA。但该方法的缺点是成本高，实验设备要求高，普通实验室无法使用且灵敏度稍低。

近年来，我国新城疫的流行特点出现了明显变化，流行毒株以基因Ⅶ型为主，非典型性新城疫多发，对我国养禽业造成了巨大损失。

发明内容

针对上述现有技术中存在的问题与缺陷，本发明的目的旨在提供一种用于鉴别新城疫Lasota疫苗毒株和基因Ⅶ型流行毒株的诊断试剂盒。

实现上述发明目的的技术方案是一种鉴别新城疫Lasota疫苗毒株和基因Ⅶ型流行毒株的诊断试剂盒，该试剂盒由反转录混合液、一扩混合液、二扩混合液、阴性对照和阳性对照组成；

所述反转录混合液由DEPC处理灭菌水、2.5m mol·L^-1dNTP、5×AMV Buffer 、25 μmol·L^-1 NDV-1F上游引物、5U/μL AMV反转录酶和40U/μL HPR I RNA酶抑制剂组成；每个反应体积比为10：4：4：1：0.5：0.5，共计20μL，50个反应共计1000μL，装成1管；

所述一扩混合液由灭菌三蒸水、10×PCR Buffer、2.5m mol·L^-1dNTP、25 μmol·L^-1 NDV-1F上游引物、25 μmol·L^-1 NDV-1R下游引物、5U/μL rTaq DNA聚合酶组成，每个反应体积比为17：2.5：2：0.5：0.5：0.5，共计23 μL，50个反应共计1150μL，装成1管；