[发明专利]一种噬菌体展示表达圆环病毒抗原疫苗的制备方法

摘要

本发明提供一种噬菌体展示表达圆环病毒抗原疫苗的制备方法，包括以下步骤：提取猪圆环病毒Ⅱ型(PCV2)RNA，反转录，聚合酶链式反应(PCR)扩增获取猪Ⅱ型圆环病毒ORF2基因开放阅读框片段，并铆定定向插入T4噬菌体；利用免疫筛选的方法获取具有ORF2基因的T4噬菌体；经纯化后重新侵染X-Blue ST1(CCTCC M 2014397)宿主细胞；发酵培养获得的X-BlueST1宿主细胞，诱导表达灭活后培养物作为抗原；ELISA标定抗原效价，并用生理盐水倍比稀释抗原终浓度为10⁷U/ml；1:2.5的比例加入疫苗佐剂，即为疫苗。本发明利用噬菌体表达猪圆环病毒Ⅱ型抗原并制备疫苗，避免了弱毒疫苗毒力返强风险，且采用发酵培养利于大规模工业化生产，成本远低于通过细胞培养的方式生产疫苗。

主权项

一种噬菌体展示表达圆环病毒抗原疫苗的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：提取猪圆环病毒Ⅱ型(PCV2)病毒培养液RNA，反转录，聚合酶链式反应(PCR)扩增获取猪Ⅱ型圆环病毒ORF2开放阅读框基因片段，制成改造后的ORF2基因片段，然后将所述猪圆环病毒Ⅱ型ORF2基因片段铆定定向插入T4噬菌体；利用所述T4噬菌体侵染X‑Blue ST1CCTCC M2014397宿主细胞，原核表达OFR2基因重组蛋白，并免疫动物制备多抗，利用制备的猪圆环病毒Ⅱ型多抗对插入ORF2基因片段的所述噬菌体进行免疫筛选，获取阳性克隆斑，扩增并测序鉴定插入序列的正确性；获取具有正确插入ORF2基因的T4噬菌体；经纯化后重新侵染X‑Blue ST1CCTCC M 2014397宿主细胞；噬菌体再次侵染X‑Blue ST1CCTCC M 2014397宿主细胞，发酵培养，OD值为0.6时，加入终浓度为100μg/ml异丙基‑β‑D‑硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达2h，诱导表达后培养物加入终浓度为1％的甲醛并在4℃，转速为120r/min下震荡灭活24小时；处理后的培养物作为免疫抗原；利用PCV2弱毒疫苗免疫猪，制备猪的抗PCV2病毒的阳性血清；利用间接酶联免疫吸附剂测定(ELISA)方法检测制备的抗PCV2血清的效价，再根据所测得的效价，把抗体效价稀释成为1:300；用标定好的抗血清检测培养物抗原效价，并用生理盐水倍比稀释，稀释抗原终浓度为107U/ml；以1:2.5的比例加入疫苗佐剂，即得到最终所获得疫苗。