[发明专利]一种噬菌体展示表达圆环病毒抗原疫苗的制备方法

权利要求书

1.一种噬菌体展示表达圆环病毒抗原疫苗的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：

提取猪圆环病毒Ⅱ型(PCV2)病毒培养液RNA，反转录，聚合酶链式反应(PCR)扩增获取猪Ⅱ型圆环病毒ORF2开放阅读框基因片段，制成改造后的ORF2基因片段，然后将所述猪圆环病毒Ⅱ型ORF2基因片段铆定定向插入T4噬菌体；利用所述T4噬菌体侵染X-Blue ST1CCTCC M2014397宿主细胞，原核表达OFR2基因重组蛋白，并免疫动物制备多抗，利用制备的猪圆环病毒Ⅱ型多抗对插入ORF2基因片段的所述噬菌体进行免疫筛选，获取阳性克隆斑，扩增并测序鉴定插入序列的正确性；获取具有正确插入ORF2基因的T4噬菌体；经纯化后重新侵染X-Blue ST1CCTCC M 2014397宿主细胞；

噬菌体再次侵染X-Blue ST1CCTCC M 2014397宿主细胞，发酵培养，OD值为0.6时，加入终浓度为100μg/ml异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达2h，诱导表达后培养物加入终浓度为1％的甲醛并在4℃，转速为120r/min下震荡灭活24小时；处理后的培养物作为免疫抗原；利用PCV2弱毒疫苗免疫猪，制备猪的抗PCV2病毒的阳性血清；利用间接酶联免疫吸附剂测定(ELISA)方法检测制备的抗PCV2血清的效价，再根据所测得的效价，把抗体效价稀释成为1:300；用标定好的抗血清检测培养物抗原效价，并用生理盐水倍比稀释，稀释抗原终浓度为107U/ml；以1:2.5的比例加入疫苗佐剂，即得到最终所获得疫苗。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述猪圆环病毒Ⅱ型ORF2基因片段铆定定向插入T4噬菌体方法为：将所述改造后的ORF2基因片段连接插入pMD-18T载体，制成pMD-18T-ORF2；利用EcoR Ⅰ和hindIII双酶切，回收酶切片段，并用EcoR Ⅰ和hindIII酶切T4噬菌体表达质粒；回收酶切片段，T4连接酶连接基因片段到T4噬菌体的SOC位点。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述猪圆环病毒Ⅱ型多抗的制备方法为：

用EcoRⅠ和hindIII分别双酶切重组克隆质粒pMD-18T-ORF2和表达载体pET-28a(+)；以4μl ORF2基因片段、1μl pET-28a(+)载体片段、1μl T4DNA酶、1μl连接酶缓冲液、3.5μl ddH2O的体系，4℃连接过夜，将连接产物转化到Top10感受态细胞中，冰浴30min，42℃热应激90s，冰浴2-3min，加1ml LB液体培养基37℃摇40min，均匀涂在含氨苄西林(100μg/ml)的LB平板上37℃培养过夜；挑取阳性菌落，摇菌，提取质粒，进行聚合酶链式反应(PCR)和双酶切鉴定，得到pET-28a-ORF2；

将所述pET-28a-ORF2转化入感受态E.coli BL21(DE3)中，在含50μg/ml卡那霉素的LB固体培养基上培养过夜；挑取单菌落，加入含卡那霉素(50μg/ml)的LB液体培养基中，37℃振荡培养至菌液A600达0.4-0.6时，加入终浓度为1mM的异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达，37℃振荡诱导4h，离心，收集菌体；取1ml菌液，4℃，8000g/min离心5min，保留沉淀物，菌体用PBS反复冲洗两次，再进行超声，超声仪设置为130W、开5s、停5s，超声30min，12000r/min离心15min，收集沉淀；向沉淀物中加入70μl 1×TE缓冲液，重悬沉淀，加入4.5μl二硫苏糖醇(DTT)，2μl 5×上样缓冲液，煮沸10min，4℃，10000g离心10min，取15μl上清进行SDS-PAGE分析；条带正确后，用含有8M尿素的缓冲液重悬沉淀；4℃条件下溶解1h；过镍柱，分离纯化表达的重组蛋白，对纯化复性的原核表达蛋白进行梯度复性，并透析浓缩；用纯化复性的原核表达蛋白免疫猪(每头20mg),三免后采血，重组蛋白抗原包被ELISA检测抗体效价，抗体效价大于1:16时，采血，静置析出，离心后获得血清作为多抗。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述原核表达，表达并纯化所述猪圆环病毒Ⅱ型ORF2重组蛋白，用重组蛋白制备多克隆血清，并利用获取的阳性多克隆血清，把插入ORF-2基因的T4噬菌体从T4噬菌体文库中筛选出来，免疫筛选获取阳性克隆斑，纯化测序鉴定，并把其作为侵染新的X-Blue ST1CCTCC M 2014397宿主细胞的种毒。

5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述疫苗佐剂为化妆品级白油。