[发明专利]一种噬菌体展示表达圆环病毒抗原疫苗的制备方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，特别涉及一种噬菌体展示表达圆环病毒抗原疫苗的制备方法。

背景技术

猪圆环病毒感染是由圆环病毒引起的猪的一种急性传染病。主要特征为消瘦、体质下降、贫血、黄疸、腹泻、发育不良、呼吸困难、母猪繁殖障碍的。伴有广泛的病理化。根据其血清型的不同可分为PCV1及PCV2。其中我国报道较多感染比较严重的为PCV2。目前治疗PCV2的方法多方法复杂，成本较高，从技术上取得的效果收益甚微。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种噬菌体展示表达圆环病毒抗原疫苗的制备方法，用以控制猪圆环病毒Ⅱ型病的感染，减少危害。

本发明提供了一种噬菌体展示表达圆环病毒抗原疫苗的制备方法，为了对披露的实施例的一些方面有一个基本的理解，下面给出了简单的概括。

本发明的一种噬菌体展示表达圆环病毒抗原疫苗的制备方法包括以下步骤：

提取猪圆环病毒Ⅱ型(PCV2)病毒培养液RNA，反转录，聚合酶链式反应(PCR)扩增获取猪Ⅱ型圆环病毒ORF2开放阅读框基因片段，制成改造后的ORF2基因片段，然后将所述猪圆环病毒Ⅱ型ORF2基因片段铆定定向插入T4噬菌体；利用所述T4噬菌体侵染X-Blue ST1 CCTCC M 2014397宿主细胞，原核表达OFR2基因重组蛋白，并免疫动物制备多抗， 利用制备的猪圆环病毒Ⅱ型多抗对插入ORF2基因片段的所述噬菌体进行免疫筛选，获取阳性克隆斑，扩增并测序鉴定插入序列的正确性；获取具有正确插入ORF2基因的T4噬菌体；经纯化后重新侵染X-Blue ST1 CCTCC M 2014397宿主细胞；

噬菌体再次侵染X-Blue ST1 CCTCC M 2014397宿主细胞，发酵培养，OD值为0.6时，加入终浓度为100μg/ml异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达2h，诱导表达后培养物加入终浓度为1％的甲醛并在4℃，转速为120r/min下震荡灭活24小时；处理后的培养物作为免疫抗原。利用PCV2弱毒疫苗免疫猪，制备猪的抗PCV2病毒的阳性血清；利用间接酶联免疫吸附剂测定(ELISA)方法检测制备的抗PCV2血清的效价，再根据所测得的效价，把抗体效价稀释成为1:300；用标定好的抗血清检测培养物抗原效价，并用生理盐水倍比稀释，稀释抗原终浓度为107U/ml；以1:2.5的比例加入疫苗佐剂，即得到最终所获得疫苗。

其中，以下菌株保藏于中国典型培养物保藏中心：

大肠杆菌Escherichia coli X-Blue ST1；

保藏编号：CCTCC M 2014397；

保藏日期：2014年9月1日；

简称为X-Blue ST1；

保藏于中国，武汉，武汉大学。

本发明的有益效果如下：

通过制备带有PCV2病毒的噬菌体展示表达抗原，并把其制备成疫苗，取得较好的保护效果。且可以大量生产只需细菌发酵培养，生产成本低于现行的细胞培养。由于噬菌体展示表达圆环病毒抗原疫苗是重组单蛋白抗原，并且T4噬菌体感染具有细胞嗜性，避免了现行活疫苗返毒及引入外援病原体感染的风险。该疫苗易于制备且利于大规模生产及使用。

为了上述以及相关的目的，一个或多个实施例包括后面将详细说明并在权利要求中特别指出的特征。

附图说明

图1ORF2基因PCR扩增产物电泳图；

图2ORF2抗原蛋白的抗原表位分析。

具体实施方式

以下优选实施例，对本发明作详细描述，以使本领域的技术人员能够实践它们。

下面对本发明做详细描述。

实施例1猪圆环病毒Ⅱ型ORF2基因的获取及免疫筛选多抗的制备

1猪圆环病毒Ⅱ型ORF2基因的获取。 

GENBANK上查找PCV2的ORF2序列，根据所获得的序列查找开放阅读框，并根据开放阅读框的序列设计以下引物：

上游引物5’-CGGGTACCGCCACCATGACGTATCCAAGGAGGC-3’

下游引物5’-GCGGATCCTCACTTAGGGTTAAGTGGGGGG-3’

提取猪圆环病毒Ⅱ型病毒培养液的mRNA，反转录为cDNA,并以此为模板PCR扩增ORF2片段，目的基因扩增结果如图1所示，704bp中为目的条带，连接PMD-18T载体，测序获得的基因片段的特征如下：