[发明专利]一种包含表达功能性重组人凝血因子Ⅶ载体的宿主细胞及其高水平表达方法

摘要

一种包含表达功能性重组人凝血因子Ⅶ载体的宿主细胞及其高水平表达方法，目的是构建含FⅦ、GGCX及VKORC1重组核酸的表达载体，利用GGCX及VKORC1的协同表达提高重组FⅦ的g‑羧基化修饰；本发明宿主细胞包含编码维生素K依赖的人凝血因子Ⅶ（FⅦ）重组核酸、小鼠维生素K还原酶复合体亚基1（VKORC1）重组核酸和小鼠g氨基酸羧化酶（GGCX）重组核酸，以及绝缘子insulator（4X）重组核酸；高水平表达功能性人凝血因子Ⅶ的方法包括构建一种表达载体，利用脂质体法将该表达载体介导进入DHFR缺陷型CHO动物细胞内，DMEM培养基筛选阳性克隆；无血清驯化培养该宿主细胞株；利用镍离子亲和层析纯化hFⅦ重组蛋白，SDS‑PAGE及Western blot检测；凝血酶原时间(PT)测定FⅦ重组蛋白促凝血活性。

主权项

一种包含表达功能性重组人凝血因子Ⅶ载体的宿主细胞，其特征在于包含编码维生素K依赖的人凝血因子Ⅶ（FⅦ）重组核酸、小鼠维生素K还原酶复合体亚基1（VKORC1）重组核酸和小鼠γ氨基酸羧化酶（GGCX）重组核酸，以及绝缘子“insulator（4X）”重组核酸；其中FⅦ、VKORC1和GGCX通过内部核糖体进入位点（IRES）连接，利用CAG启动子启动；绝缘子“insulator（4X）”重组核酸由经部分改造的鸡HS4绝缘体单元4倍串联而成，其核苷酸序列为SEQ ID NO:1；FⅦ、VKORC1和GGCX在宿主细胞中均获得稳定表达。