[发明专利]一种包含表达功能性重组人凝血因子Ⅶ载体的宿主细胞及其高水平表达方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及包含一种表达载体的宿主细胞，所述表达载体包含：编码维生素K依赖的人凝血因子Ⅶ（FⅦ）重组核酸、小鼠维生素K还原酶复合体亚基1（VKORC1）重组核酸和小鼠g氨基酸羧化酶（GGCX）重组核酸，以及绝缘子insulator（4X）重组核酸。其中小鼠维生素K还原酶复合体亚基1（VKORC1）和小鼠g氨基酸羧化酶（GGCX），及人凝血因子Ⅶ（FⅦ）在所述的宿主细胞中均获得稳定表达。本发明同时还涉及一种可高水平表达功能性人凝血因子Ⅶ的方法，该宿主细胞在特定条件和规模下培养可显著提高功能性人凝血因子Ⅶ的产率。

背景技术

凝血因子Ⅶ(coagulation factor Ⅶ, FⅦ)是一种维生素K依赖的单链糖蛋白，主要由肝脏合成，是凝血块形成起始的关键分子之一，在凝血过程中发挥着极其重要的作用。FⅦ主要通过与组织因子（tissue facter, TF）结合，形成TF-FⅦ复合物，从而启动外源凝血途径，并对内源性凝血途径具有特殊的调控作用。人FⅦ在血浆中主要以酶原形式存在，当FⅦ的Arg₁₅₂-Ile₁₅₃之间的肽链裂解后，由单链形式转变为双链形式，形成活性FⅦa。FⅦa由含153个氨基酸、分子量为20 kDa的轻链，含254个氨基酸、分子量为30 kDa的重链，通过原135位和262位氨基酸之间形成的二硫键连接。临床研究表明, FⅦ对血小板减少症和血小板功能障碍、严重创伤、大面积外科手术的止血具有令人满意的治疗效果。而目前药用FⅦ的主要来源为血浆提取，但血浆中FⅦ含量很低，仅有200-400 mg/ml，难以满足临床需要；同时血浆提取制备工艺复杂，批间差异较大、稳定性较差；而且以血浆作为原料，大大增加了外源病毒的感染风险。

血浆提取制备FⅦ，由于含量有限、工艺复杂、感染风险等原因而受到限制，基因重组制备FⅦ成为开发和研究的重点，而基因工程技术的发展也为FⅦ的体外重组制备提供了可能。FⅦ的凝血活性功能需要复杂的翻译后加工，包括谷氨酸的g-羧基化、天冬氨酸的β-羟基化、N-糖基化、O-糖基化等，因此必须利用具有复杂的蛋白后加工的真核表达系统来完成。目前已有包括酵母表达系统和哺乳动物细胞表达系统的多种FⅦ重组制备策略被公开(参见CN101376875A, CN102321668A, CN101906438A )，在一定程度上实现了FⅦ的重组表达。然而其中具有g-羧基谷氨酸区修饰的功能性重组蛋白却含量甚少，成为阻碍其进一步开发利用的瓶颈。g-羧基谷氨酸区（也称“Gla”区）的翻译后修饰，是FⅦ保持凝血活性的关键。而Gla修饰，是g氨基酸羧化酶（GGCX）在还原型维生素K辅酶作用下的结果(de Visser MC, Roshani S, Rutten JW, van Hylckama Vlieg A, Vos HL, Rosendaal FR, Reitsma PH., 2011. Haplotypes of VKORC1, NQO1 and GGCX, their effect on activity levels of vitamin K-dependent coagulation factors, and the risk of venous thrombosis.Thromb Haemost.106(3):563-565.)。在Gla修饰中，还原型维生素K被GGCX氧化形成维生素K环氧化物，然后维生素K环氧化物又被还原酶复合体亚基1（VKORC1）再循环为还原型维生素K参与羧基化修饰。因此，GGCX和VKORC1是FⅦ进行谷氨酸g-羧基化、保证凝血活性的关键酶蛋白。然而研究发现，细胞培养基中外源维生素K的添加，无法提高FⅦ的表达水平（参见CN101124320A）；FⅦ与VKORC1的共表达对其表达水平的提高也贡献有限（参见CN101124320A）；且与GGCX的协同表达，也难以实现功能性FⅦ的有效释放（参见CN101124320A）。因此，VKORC1作用下还原型维生素K的供应形式，是该反应的限速步骤；GGCX和 VKORC1的协同作用是活性FⅦ稳定高水平表达的关键。已有报道通过FⅦ、GGCX及VKORC1的共表达在一定程度上提升提高了功能性FⅦ的表达水平（参见CN101198696A）。然而由于不同启动子之间的启动强度差异，以及外源基因片段过大，共表达基因之间的相互影响，导致功能性FⅦ的整体生产率依然较低。绝缘体是一类独特的染色质调控元件，可通过阻止异染色质扩散，降低共表达单元相互影响，维持被保护基因的持续表达，从而有效提高目的基因的表达水平（参见CN101285072A）。通过插入绝缘子基因单元提高外源基因的转录和合成水平，是目前活性蛋白质制备的一种有效策略。