[发明专利]一种包含表达功能性重组人凝血因子Ⅶ载体的宿主细胞及其高水平表达方法

权利要求书

1.一种包含表达功能性重组人凝血因子Ⅶ载体的宿主细胞，其特征在于包含编码维生素K依赖的人凝血因子Ⅶ（FⅦ）重组核酸、小鼠维生素K还原酶复合体亚基1（VKORC1）重组核酸和小鼠γ氨基酸羧化酶（GGCX）重组核酸，以及绝缘子“insulator（4X）”重组核酸；其中FⅦ、VKORC1和GGCX通过内部核糖体进入位点（IRES）连接，利用CAG启动子启动；绝缘子“insulator（4X）”重组核酸由经部分改造的鸡HS4绝缘体单元4倍串联而成，其核苷酸序列为SEQ ID NO:1；FⅦ、VKORC1和GGCX在宿主细胞中均获得稳定表达。

2.如权利要求1所述的一种包含表达功能性重组人凝血因子Ⅶ载体的宿主细胞，其特征是编码维生素K依赖的hFⅦ重组核酸和二氢叶酸还原酶（DHFR）重组核酸通过内部核糖体进入位点（IRES）连接，利用CAG启动子启动；编码VKORC1重组核酸和GGCX重组核酸同样通过IRES连接，CAG启动子启动；且两个启动子组成的重组核酸表达单元通过绝缘子“insulator（4X）”重组核酸隔离。

3.如权利要求1或2所述的包含表达功能性重组人凝血因子Ⅶ载体的宿主细胞，其特征在于绝缘子“insulator（4X）”重组核苷酸插入位置为两个启动子组成的重组核酸表达单元的下游。

4.如权利要求1或2所述的包含表达功能性重组人凝血因子Ⅶ载体的宿主细胞，其特征在于所述编码维生素K依赖的人凝血因子Ⅶ（FⅦ）重组核酸其核苷酸序列为SEQ ID NO:2；所述编码小鼠维生素K还原酶复合体亚基1（VKORC1）重组核酸其核苷酸序列为SEQ ID NO:3；所述编码小鼠γ氨基酸羧化酶（GGCX）重组核酸其核苷酸序列为SEQ ID NO:4。

5.如权利要求1所述的包含表达功能性重组人凝血因子Ⅶ载体的宿主细胞，其特征是该宿主细胞为DHFR缺陷型CHO哺乳动物细胞。

6.一种功能性重组人凝血因子Ⅶ的高水平表达方法，其特征是：

1）构建一种表达载体，该表达载体中FⅦ重组核酸通过IRES与DHFR重组核酸连接，由CAG启动子启动共表达；同时含有CAG启动子启动、由IRES连接VKORC1重组核酸和GGCX重组核酸组成的表达单元；两个重组核酸表达单元由绝缘子“insulator（4X）”重组核酸隔离，“insulator（4X）”插入位置为两个启动子组成的重组核酸表达单元的下游；

2）利用脂质体法将1）所述表达载体介导进入DHFR缺陷型CHO动物细胞内，DMEM培养基筛选阳性克隆；利用有限稀释法亚克隆稳定表达细胞株；挑选高表达阳性克隆扩大培养，氨甲喋呤(MTX)梯度加压筛选，提高hFⅦ表达水平；

3）无血清驯化培养该宿主细胞株；

4）利用镍离子亲和层析纯化hFⅦ重组蛋白，SDS-PAGE及Western blot检测；

5）凝血酶原时间(PT)测定FⅦ重组蛋白促凝血活性。