[发明专利]一种中枢神经系统中特异表达miR-505的载体的制备方法

摘要

本发明涉及一种中枢神经系统中特异表达miR-505的载体的制备方法，包括：用PCR方法获得目的基因，将GFAP启动子从pAAV-GFAP-hchR2-mcherry-WPRE载体上用合适的限制性内切酶切下，与目的基因连接克隆到pUC19载体上，然后通过合适的酶切位点将GFAP-EGFP-mir-505片段从pUC载体上切下，克隆到PB载体上，获得载体。本发明可与表达转座酶的辅助载体共注射小鼠的受精卵的雄性原核，得到转基因小鼠，用以研究miR-505在神经系统特别是在神经胶质细胞中的包括调控性发育启动在内的生物学功能，并且EGFP蛋白能方便地显示外源基因在神经系统中的定位。

主权项

一种中枢神经系统中特异表达miR‑505的载体的制备方法，包括：（1）以pcDNA6.2‑EGFP‑miR505为模板，进行PCR扩增，将PCR产物进行回收、用SphI和HindIII双酶切、纯化回收，得到EGFP‑mir‑505/SphI+HindIII片段；（2）pUC‑19用SmaI和BamHI进行双酶切，得到线性载体片段pUC19/BamHI SmaI；pAAV‑GPAP载体用MluI酶切后，以Klenow酶补平，然后以BamHI酶切，电泳分离酶切片段，回收GFAP启动子片段，与pUC19/BamHI SmaI连接，转化大肠杆菌感受态细胞，在含有氨苄青霉素的琼脂糖平板上筛选阳性克隆，得到pUC19‑GFAP载体；（3）pUC19‑GFAP用SphI和HindIII双酶切后，与（1）中得到的EGFP‑mir‑505/SphI+HindIII片段进行连接，转化大肠杆菌，得到目的片段pUC19‑GFAP‑EGFP‑mir‑505；（4）PB[Act‑RFP]DS载体用BamHI酶切，并用Klenow酶补平粘性末端后，以HindIII酶切，电泳分离回收得到PB载体片段；pUC19‑GFAP‑EGFP‑mir‑505以EcoRI酶切，并用Klenow酶补平粘性末端后，以HindIII酶切，电泳分离回收目的基因片段，与上述PB载体片段连接，得到中枢神经系统中特异表达miR‑505的载体PB[GFAP‑EGFP‑mir‑505]。