[发明专利]一种中枢神经系统中特异表达miR-505的载体的制备方法

说明书

技术领域

本发明属于转基因小鼠领域，特别涉及一种中枢神经系统中特异表达miR-505的载体的制备方法。

背景技术

MicroRNA是长度为21-25碱基单链小分子RNA，是由具有发夹结构的约70-90个碱基大小的单链RNA前体经过Dicer酶加工后生成。自从1993年第一个miRNA被报道以来，人们发现miRNAs几乎参与了所有重要的生物学过程的调控[Bartel DP(2004)MicroRNAs:genomics,biogenesis,mechanism,and function.Cell116(2):281-297]，miRNAs的异常表达与人类多种疾病相关[Ambros V,朱万渠（2010）：MicroRNAs与疾病和发育生命科学3:27-29]。迄今为止，700多种已被鉴定出来的人源性miRNAs调控了人类1/3以上基因的表达。miR-505位于小鼠X染色体X:57647578-57647667处，ATP11C基因的第一和第二外显子之间的第一个内含子中，对于其生物学功能的研究目前还处于起步阶段。2010年，Verduci L等发现miR-505能通过作用于其靶标ASF/SF2（可变剪接因子）发挥调控小鼠胚胎成纤维细胞的增殖和衰老/凋亡的作用[Verduci,L,Simili M,Rizzo M,Mercatanti A,Evangelista M et al.(2010)MicroRNA(miRNA)-mediated Interaction between Leukemia/Lymphoma-related Factor(LRF)and Alternative splicing factor/splicing factor2(ASF/SF2)affects mouse embryonic fibroblast senescence and apoptosis.J Biol Chem,285:39551-39563]，ASF/SF2也成为目前唯一经实验验证过的miR-505的靶蛋白。Karni R等发现在许多细胞中转染ASF/SF2可以激活mTOR部分信号通路[Karni R,Hippo Y,Lowe SW,Krainer AR(2008)The splicing-factor oncoprotein SF2/ASFactivates mTORC1.Proc Natl Acad Sci USA105(40):15323-15327]，但是ASF参与调控mTOR的具体方式还不清楚。Yamamoto Y等在研究肿瘤多药抗性时，发现miR-505是一个新的肿瘤抑制miRNA，与其呈现负相关的蛋白Akt3，与mTOR通路上的AKT属于同一基因家族[Yamamoto Y,Yoshioka Y,Minoura K,Takahashi R,Takeshita F et al.,(2011)An integrative genomic analysis revealed the relevance of microRNA and gene expression for drug-resistance in human breast cancer cells.Mol Cancer,10:13539551-39563]。因此我们有理由推测，miR-505可能参与调控mTOR信号通路，而具体的作用机制有待进一步研究和证实。mTOR信号通路被证明参与了大鼠的性发育启动调控，而小鼠性发育启动的调控中枢在下丘脑神经元，因此在神经元中特异性高表达miR-505对研究miR-505的生物学功能有重要的作用。

GFAP是胶质细胞酸性蛋白，其启动子能指导在转基因小鼠的神经胶质细胞中特异表达外源蛋白[Nolte C,Matyash M,Pivneva T,Schipke cg,Ohlemeyer C,Hanisch U,Kirchhoff F and Kettenmann H,(2001)GFAP promoter-controlled egfp expressing transgenic mice:a tool to visualize astrocytes and astrogliosis in living brain tissue.GLIA33:72–86]。因此在本研究中采用GFAP启动子来指导在神经元中特异性表达外源的miR505，同时导入EGFP基因来指示外源基因在小鼠中枢神经系统中的表达区域，将这些表达元件构建在PB表达载体上。