[发明专利]一种中枢神经系统中特异表达miR-505的载体的制备方法

权利要求书

1.一种中枢神经系统中特异表达miR-505的载体的制备方法，包括：

（1）以pcDNA6.2-EGFP-miR505为模板，进行PCR扩增，将PCR产物进行回收、用SphI和HindIII双酶切、纯化回收，得到EGFP-mir-505/SphI+HindIII片段；

（2）pUC-19用SmaI和BamHI进行双酶切，得到线性载体片段pUC19/BamHI SmaI；pAAV-GPAP载体用MluI酶切后，以Klenow酶补平，然后以BamHI酶切，电泳分离酶切片段，回收GFAP启动子片段，与pUC19/BamHI SmaI连接，转化大肠杆菌感受态细胞，在含有氨苄青霉素的琼脂糖平板上筛选阳性克隆，得到pUC19-GFAP载体；

（3）pUC19-GFAP用SphI和HindIII双酶切后，与（1）中得到的EGFP-mir-505/SphI+HindIII片段进行连接，转化大肠杆菌，得到目的片段pUC19-GFAP-EGFP-mir-505；

（4）PB[Act-RFP]DS载体用BamHI酶切，并用Klenow酶补平粘性末端后，以HindIII酶切，电泳分离回收得到PB载体片段；pUC19-GFAP-EGFP-mir-505以EcoRI酶切，并用Klenow酶补平粘性末端后，以HindIII酶切，电泳分离回收目的基因片段，与上述PB载体片段连接，得到中枢神经系统中特异表达miR-505的载体PB[GFAP-EGFP-mir-505]。

2.根据权利要求1所述的一种中枢神经系统中特异表达miR-505的载体的制备方法，其特征在于：所述步骤（1）中PCR扩增所用引物为：

上游引物GCGCATGCCTAGAGAACCCACTGCTTAC；

下游引物GCAAGCTTGCTATGGCAGGGCCTGCCG。

3.根据权利要求1所述的一种中枢神经系统中特异表达miR-505的载体的制备方法，其特征在于：所述步骤（1）中PCR反应体系为：GTbuffer1.5μl，2.5mM dNTP1.5μl，上下游引物1.5μl，BSA0.2μl，Taq0.2μl，原液0.1μl，H₂O10μl；PCR反应条件为：93℃1min30s；93℃30s，57℃30s，65℃2min，40个循环；65℃10min。

4.根据权利要求1所述的一种中枢神经系统中特异表达miR-505的载体的制备方法，其特征在于：所述步骤（1）中双酶切反应体系为：SphI1μl，HindIII1μl，10*M buffer5μl，PCR产物15μl，H₂O28μl。

5.根据权利要求1所述的一种中枢神经系统中特异表达miR-505的载体的制备方法，其特征在于：所述步骤（2）中SmaI酶切反应体系为：SmaI2μl，10*T buffer4μl，0.1%BSA4μl，质粒5μl，H₂O35μl；BamHI酶切反应体系为：BamHI2μl，10*K buffer4μl，质粒7.7μl，H₂O36.3μl。

6.根据权利要求1所述的一种中枢神经系统中特异表达miR-505的载体的制备方法，其特征在于：所述步骤（2）中MluI酶切反应体系为：MluI2μl，10*H buffer5μl，质粒4μl，H₂O40μl；补平产物BamHI酶切反应体系为：BamHI2μl，10*K buffer5μl，GFAP5μl，H₂O38μl。