[发明专利]一种黄曲霉毒素纳米抗体基因库、构建方法、用途及黄曲霉毒素B1纳米抗体2014AFB-G15

摘要

本发明涉及黄曲霉毒素纳米抗体基因库、构建方法、用途及黄曲霉毒素B1纳米抗体2014AFB-G15。所述黄曲霉毒素纳米抗体基因库是通过提取免疫黄曲霉毒素B1抗原后的羊驼血液中的RNA，并采用RT-PCR的方法特异性扩增羊驼重链抗体可变区基因得到黄曲霉毒素纳米抗体VHH基因，然后与pCANTAB5E（his）载体连接后转化得到。本发明筛选得到的黄曲霉毒素B1纳米抗体2014AFB-G15具有耐有机试剂、耐高温等特性，稳定性好；对黄曲霉毒素B1的50%抑制浓度IC₅₀为0.66ng/mL，对黄曲霉毒素B2、G1、G2、M1的交叉反应率分别为22.6%、0.95%、32.1%和26%。

主权项

黄曲霉毒素纳米抗体基因库，其特征在于：提取经黄曲霉毒素B1抗原免疫后的羊驼血液中的RNA，并采用RT‑PCR的方法特异性扩增羊驼重链抗体IgG2和IgG3的可变区基因，即VHH基因，然后与pCANTAB 5E（his）载体连接后转化得到；所述pCANTAB 5E（his）载体是通过如下方法构建得到：以pCANTAB5E载体质粒为模板，通过上游引物：p5E SfiI‑F:5’‑ATGCGGCCCAGCCGGCC‑3’(SfiI)；下游引物：p5E N‑P‑H‑R: 5’‑ ATCGGGCCCTGTGGTGGTGGTGGTGGTGTGCGGCCGCCCGTT TTC‑3’PCR扩增pCANTAB5E载体质粒上Sfi I 到NotI之间的DNA片段，得到p5E‑his片段；然后将p5E‑his片段，先做SfiI单酶切再做PspoMI单酶切，得p5E‑his(SfiI/PspoMI) 粘性末端，将pCANTAB5E载体质粒先做SfiI单酶切再做Not I单酶切，得p5E（SfiI/NotI）粘性末端；最后将p5E‑his(SfiI/PspoMI) 粘性末端和p5E（SfiI/NotI）粘性末端连接后，得到pCANTAB 5E（his）载体。